Улитка станок: Ошибка 404. Страница не найдена — Объявления на сайте Авито

Сервис объявлений OLX: сайт объявлений в Украине

500 грн. Договорная Харьков, Основянский Сегодня 17:59

Винница, Ленинский Сегодня 17:58

1 300 грн. Договорная Черкассы Сегодня 17:58

Днепр, Центральный Сегодня 17:58

Жмеринка Сегодня 17:58

13 500 грн. Договорная Киев, Шевченковский Сегодня 17:58

Харьков, Киевский Сегодня 17:58

Станок для холодной ковки Улитка + Трубогиб

Производим и продаем без предоплаты станки для холодной ковки. Оплата после осмотра товара в транспортной компании. Доставка по России БЕСПЛАТНО. Продаю многоцелевой настольный станок с трубогибом для холодной ковки и получения кованых изделий из профильной трубы, квадрата, полосы и прутка, арок для навесов, теплиц и мангалов.  Станок имеет две модификации — на 220 вольт — на 380 вольт. Управление станком осуществляется при помощи ножной педали. Преимущества станка Вы сможете из профильной трубы 15х15 и 20х20мм БЕЗ ПЕРЕНАЛАДОК изготовить кованые элементы, выполнив поочередно ⁃ усиление профиля ⁃ оттяжку плоской лапки ⁃ изготовить «бублики» и завитки требуемого размера и формы (всего 9 видов и размеров, максимальный диаметр 400мм).  Кроме этого станок может сделать — изгиб профильных труб размером до 60х60 мм или несколько труб общей шириной до 80 мм (арок для теплиц, навесов и т.п.) — усиление профильной трубы 25 мм и ее плоское окончание — оттяжку плоской лапки и окончание «гусиная лапка» из квадрата со стороной до 16мм (на горячую) — изготовить «корзинки» («фонарики») из квадрата от 5х5мм до 10х10мм (приспособление «торсион-фонарики») — выполнить продольное скручивание квадрата со стороной до 16 мм на длину 1м. Станок оснащен мотор-редуктором мощностью 2,2 кВт (380 В). В комплект входит частотный преобразователь на 220В или 380В (на выбор заказчика). Частота вращения валов регулируется от 5 до 35 оборотов в минуту. Валы выполнены из легированной конструкционной стали с термической обработкой.  За дополнительную плату станок может быть дооснащен ⁃ приспособлением «кольцо» для навивки колец из квадрата, круглого прутка ⁃ формующими роликами для получения на профильной трубе уникального рисунка ⁃ комплектом матриц для выполнения «бубликов» и «завитков» из профильной трубы со стороной 25мм и более. Масса станка с навесным оборудованием составляет 250 кг. Габариты станка Длина 960 мм. Ширина 560 мм. Высота 650 мм. УСЛОВИЯ ОПЛАТЫ И ДОСТАВКИ ТОВАРА Мы отправим станок без предоплаты на Ваше имя до терминала транспортной компании в Вашем городе. После получения уведомления о доставке груза, Вам необходимо прийти на терминал, осмотреть товар и, если Вас все устраивает, оплатить его. Забираете и запускаете оборудование в работу! Станок не требует специального обслуживания! 

Количество просмотров 6

• Контакт: Магазин
• Местоположение: Орловская область / Орел
• Полный адрес: Орел, улица Михалицына, 10
• Промышленное
• Не определено

АЛМИР Все необходимое для камнеобработки

     Купить инструмент для камня и химию для камня недорого в Москве и с доставкой по России можно в офисе ООО «Компания АЛМИР». В каталоге нашей компании, в нашем выставочном зале и на складе в Москве представлены самые известные мировые бренды оборудования для камнеобработки, которые отлично зарекомендовали себя на международном рынке. Мы предлагаем вашему вниманию широкий выбор алмазного, абразивного и твердосплавного инструмента для обработки природного и искусственного камня, химии для камня, станков для резки и полировки каменных плит.

     Офис и склад ООО «Компания АЛМИР» это реальное место в Москве, где Вы можете получить профессиональную консультацию и приобрести оригинальный инструмент, оборудование и химические средства для обработки природного и искусственного камня — мрамора и гранита. Мы быстро оформим все нужные документы, соберем и поможем погрузить Ваш заказ.

     У нас всегда в наличии около 3000 товаров для работы с камнем — алмазный и абразивный режущий и полировальный инструмент; станки и ручные машины для резки и шлифовки камня; химия для камня — защитные и декоративные пропитки, усилители цвета, полироли и воски для камня, декоративные лаки и краски для камня; клея, мастики, нейтральные силиконовые и полиуретановые герметики для склейки камня, изготовления мозаик, инкрустаций и заполнения швов.

     ООО «Компания АЛМИР» уже много лет является официальным дистрибьютором следующих всемирных брендов:

     ABRASIVI ADRIA / АБРАЗИВИ АДРИЯ (алмазные и абразивные сегменты для полировки мрамора и гранита, суппорты), специализированная химия и клея для камня (проявитель цвета на камне, эпоксидные клея для гранита, полиэфирные клеи и мастики по мрамору), ACHILLI / АКИЛЛИ / АХИЛЛИ (камнерезные станки, стационарные и портативные станки для резки камня, машины для шлифовки и полировки каменных полов и ступеней LM-30 CE, MEC-7 CE, EUROPA 88-CE, тераццо, машины для переполировки и полировки мрамора, система SLOT, ).

     ABRESSA / АБРЕССА  — широкий ассортимент инструментов для полировки камня в промышленных масштабах для одноголовочных станков и линий по полировке мраморных и гранитных плит (слебов), индустриальных абразивных и алмазных инструментов для полировки мраморных и гранитных плит (абразивные шлифовальные и полировальные круги на магнезиальной и синтетической связках для прямых и закругленных профилей на камне). Горизонтальный и вертикальный кромкообрабатывающие станки для калибровки, автоматической обработки торцов и нанесения фаски.

     AUSAVINA / ABACO / АУСАВИНА / АБАКО прищепки, зажимы, захваты и струбцины для работы с камнем, подъемные механизмы и тележки, системы хранения и пирамиды для каменных плит, центрирующее приспособление для сверления камня, стойка для сверления камня, приспособление для стягивания и выравнивания уровня каменных плит, струбцина для фиксации плит под углом 90°, устройство для фиксации моек, вращающийся стол для пескоструйной обработки и гравировки на каменных поверзностях, стенд для обработки столешниц, стенд для работы с каменными плитами, рабочий стол для работы с каменными плитами, набор струбцин с направляющими для фиксации каменных плит при склейке, зажими для ламинирования, струбцина для фиксации плит на время высыхания клея, вертикальный стенд для полировки торцов каменнных плит, зажимы одноручные, зажими двуручные, зажимы для переноски каменных плит, ручная присоска для подъема плит, присоска для подъема керамических и каменных плит, ручная присоска с ручным насосом, двойная присоска для подъема и транспортировки каменных плит, система фиксации хрупких камней, система для фиксации моек, фиксация столешниц с отверстием для мойки, набор зажимов для деталей из камня, зажимы для деревянного поддона, устройстро для захвата и перемещения каменных плит, зажим для подъема и транспортировки каменных плит, зажим для подъема плит, оборудование для работы с камнем, оборудование для транспортировки камня, оборудование для перемещения каменных плит, тележка со штангой для ручного перемещения каменных плит,тележка для транспортировки плит, тележка с функцией самоблокировки, универсальная тележка для ручного перемещенияплит, двухсторонняя тележка для перемещения плит и листов стекла, А-образная рама на 4 колесах для хранения и перемещения плит, тележка с гидравлической системой подъема и установки плит с электродвигателем, рама для транспортировки плит на грузовых автомобилях, стойка для хранения каменных плит, ремни с механизмом стяжки, вакуумный подъемник для поднятия и установки плит больших размеров, вакуумная присоска с функцией наклона с пневмоцилиндрами, вакуумный подъемник для подъема и наклона стекла с вращением, поворотный кран на колонне, стрела для вилочного погрузчика для перемещения каменных плит, стрела поворотная, стрела для вилочного погрузчика двойная, устройство для перемещения плит, приспособление для разгрузки упаковок каменных плит из закрытых контейнеров, устройство для разгрузки контейнеров с закрытым верхом, устройстро для подъемного крана, зажимы для транспортировки плит, зажим для вертикального и горизонтального подъема плиты, скоба такелажная с вертлюгом, скоба для поднятия груза, подставка резиновая для защиты кромки каменных плит, защита плит от сколов, защита краев каменных плит от повреждений, дегидратов, установка для отделения воды от шлама, дегидратор для сбора абразивного и каменного шлама, универсальных захват для крупногабаритных строительнх изделий (бордюрные блоки, бетонные ступени, гранитные детали), тандем захват для бордюрных блоков, ручной захват для брусчатки, захват для переноски вручную элементов мощения — каменной, бетонной и керамической брусчатки, станок для колки плитки и брусчатки, блокорез, станок для колки плит и брусчатки, ломик для правки швов. ломик для выравнивания линии шва при укладке брусчатки, ручной извлекатель брусчатки, устройство для извлечения уже положенной брусчатки, угольник складной для элементов мощения, оборудованиедля работы с бордюрнм камнем и брусчаткой, приспособление для полировки торцов, приспособление для полировки каменных плит, реечные пилы,

     BELLINZONI / ILPA / GENERAL / TENAX / AKEMI

     БЕЛЛИНЗОНИ / ИЛПА / ДЖЕНЕРАЛ / ТЕНАКС / АКЕМИ  — богатый ассортимент химии для камня — клей для камня, мастика для камня, мастики для мрамора, клей для гранита, очистители для камня, красители для камня, средства для полировки камня, пропитки и средства для защиты камня, очистители жира и ржавчины с камня, каменная пропитка, антидождь, пятностоп, гидрофобизатор, импрегнатор, водооталкивающая пропитка, полировальная паста (полироль), порошок для полировки камня, химическая полировка натурального камня, воск для восстановления блеска на камне, декоративные средства для камня, пропитки для защиты камня от широкого спектра загрязнений, отвердитель для шпатлевок, печатные краски для памятников и скульптур. А также химия от производителя MASSIMO PIRACCINI TREATMENT /МАССИМО ПИРАЧИНИ ТРИТМЕНТ (усилитель цвета камня, средство для защиты камня от загрязнений, от кислот, наборы по уходу за камнем, средство для камня с противоскользящим эффектом).

     BIMACK  / БИМАК (машины с планетарным механизмом для шлифовки и полировки каменных полов, полов из мрамора, полов их гранита, полировка полов из керамогранита, ступеней и стен, алмазный инструмент для полировки камня, диски из стальной шерсти, химия для камня, кристаллизаторы для мрамора, Порошок для вскрытия алмазов ACTIVATOR, щетки для антики), машины для шлифовки и полировки бетона и тераццо в промышленных масштабах, машины для чистки, шлифовки и полировки каменных поверхностей из натурального и искусственного камня, кристализации ступеней, лестниц и др. Системы грязе- и пылеудаления, водососы, промышленные пылесосы для бетона. Планетарная голова — планетарка.

     VICTOR / COLUMBUS / SOTECO ВИКТОР / КОЛУМБУС / СОТЕКО (роторные машины для шлифовки, полировки и очистки каменных полов, кристаллизации мрамора. пылеводососы для профессиональной уборки).

     BONASTRE / БОНАСТРЕ (инновационный алмазный инструмент –плашки, «черепашки», «липучки» для полировки мрамора и гранита, специальная химия для камня, кристаллизаторы для мрамора и гранита), CGS (RPF, ABRASIVI CIGIESSE) / ЧИГИЕССЕ, СиЖдиЭс — (шарошки для камня — абразивные корундовые чашки конические и цилиндрические высшего качества недорого, лепестковые абразивные круги, шлифблоки для работы без водяного охлаждения по мрамору и граниту, щетки для «антики», патинации, «кожи», лаппатуры, «Лаппато», сатинации, «сатинато»), диски из нержавеющей стали для финишнйо полировки гранита, шлифовальные алмазные инструменты, инструменты для полировки и восстановления блеска натурального камня,  композитные пэды (пады),

     DTS (АГШК — алмазные «черепашки» по американской технологии, качественные бюджетные профильные фрезы для машин Мастер и Кант по мрамору и граниту), ITALDIAM / KIRIN(алмазные турбо-диски для резки мрамора и гранита для ручных машин и стационарных станков, диски сегмент, корона, турбо-лазер, турбо-сегмент), (алмазные турбодиски для резки мрамора и гранита для ручных машин, диски с фланцем, диск без фланца, диски с боковыми сегментами, диски для расшивки швов, диски для кривого, лекального реза, Каннелюрные, профильные и калибровочные фрезы для гранита и мрамора (для работы на портативных и стационарных станках) диски с бесшумным корпусом, диски с высоким сегментом, диски с равномерным распределением алмазов, диски гальванические электроплейтед, диски тонкие и ультратонкие для резки швов, диски с усиленным корпусом, диски с впечатанным фланцем, диски для станков по хрупким камням с лазерной прорезкой,

     KINDLE DIAMOND VIEW DISK (Киндле Даймонд Вью Диск) Диск заточной для твердосплавного инструмента, держатель с шарниром для дрели

     MARTINI AEROIMPIANTI / МАРТИНИ АЭРОИМПИАНТИ (установки для очистки воды и воздуха от каменной пыли),

     OMA SYSTEM / ОМА СИСТЕМ гидравлические и электрические станки и машины для изготовления фигурного профиля и резки мрамора и гранита, профильные фрезы высшего качества по мрамору и граниту для ЧПУ, сменные сегменты для профилей,  роутеры и биты (для станков с ЧПУ (CNC) и обрабатывающих центров), машинка для резки камня, станки для производства канавочных резов (каннелюр) и полос противоскольжения GALAXY и GALAXY G8, лекальная резка, вырезание отверстий в камне, прорезка пазов на ступенях,  гидравлический врезеровальный станок ANTAREX, гидравлическое оборудование, станок для презеровки плитв из мрамора и гранита, фрезы для станка ANTAREX для сверления и резки камня, адаптеры для станка, гидравлическая углошлифовальная машина УШМ VEGA, насадка на машинку для изготовления открытых профилей, нанесение открытый профилей вручную, формирование профиля, полировка профиля. Профессиональные профилеобразующие станки (гидравлический профилеобразующий станок AUCTOR CP99 и AUCTOR A92, электрический профилеобразующий станок TAURUS MULTISPEED и MASTER 3500 — изготовиление любого профиля на каменных изделиях с прямыми или с изогнутыми краями. Мобильная гидростанция, трансформатор, рабочий стол камнеобработчика. 

Фрезы алмазные DONATELLO, изготовленные по технологии вакуумного спекания для мрамора и гранита, для работы на станках с ЧПУ (Beaver, Бивер, Сауно, Миртелс) с водяным охлаждением. 

     LUPATO / ЛУПАТО — планшайба для бучардирования MICRA L, планшайба для бучардирования TANGA L3, машина для нанесения полосы противоскольжения BIRBA на мраморе и граните, широкий роллер для нанесения декоративных насечек LONG SCRATCHING ROLLER, роллер «царапающий» барабанного типа GRAFFIATORI SCRATCHING ROLLER, планшайба для бучардирования гранита COMPENSAZIONE 4/20 на коленно-рычажных станках, специальный роллер RULLO COMPENSAZIONE 20 PUNTE (medium), твердосплавная звездочка для MICRA L для гранита и мрамора.

     SANWA KENMA / САНВА КЕНМА — самые надежные пневматические полировальные машины для камня с подачей воды, углошлифововальная машина для полировки камня KIRARA PA-2, GISON / ГИЗОН / ГИСОН – экономичные пневмомашинки для полировки камня с внутренним водяным охлаждением, пневматические шлифовально-полировальные ручные машины с подачей воды (GPW-7L, GPW 221L). TNT AIR / ТНТ АЙР  — шлифмашинки гравировальные, микрогравировальные машинки, зачистные шлифмашинки пневматические.

     FUBAG / ФУБАГ — пистолет продувочный, пистолет обдувочный для очистки различных поверхностей, пневмопистолет.

     SORMA / СОРМА (алмазные диски для резки мрамора и гранита для ручных машин и стационарных станков, алмазная наждачная бумага и изделия из нее — «притиры», «затиры», «губки», «шкурки», «черепашки», ленты, треугольники для полировки стыков и швов, алмазные напильники и фрезы), бурики алмазные для ручных машин и для ЧПУ, фрезы алмазные, бурики полимерные для полировки скульптур и барельефов из мрамора. Борфрезы, буры, насадки алмазные по мрамору и граниту, цанги, патроны кулачковые, полировальные насадки, специальные фрезы для производства фигурных профилей (профильные фрезы, набор для снятия фаски, фреза для нанесения полос противоскольжения, фреза для нанесения пазов (капельников), фреза сегментная гальваническая, фреза гальваническая для калибровки мраморных плит, фреза сегментная спеченая). Сверла торцевые для мрамора и гранита, переходники для мокрого сверления, переходники для станков ЧПУ, устройство для подвода охлаждающей жидкости. Щетки для антики.

     STONE TOOLS KOREA / VARIANT / EHWA / DIABOOM / СТОУН ТУЛС КОРЕЯ / ВАРИАНТ / ЭХВА / ИХВА / ДИАБУМ (АГШК — алмазные полировальные диски с водой и без водяного охлаждения — «черепашки», «липучки» из Кореи высшего качества, черепашки гибрид, металл, кварц, конвекс, бафф (буфф), дешевые комплекты черепах по акции для мрамора и гранита, черепашки АЛМИР, Вариант, Санни, Дракон. Суппорты, держаки для АГШК (черепашек), термоустойчивые суппорты. Полотно Велкро, VELCRO ФАТы — фрезы алмазные торцевые различных конфигураций по граниту и бетону, сверла для гранита с высоким ресурсом, турбошейпер, фрезы турбо и конвекс, диск циклон, спайдер, универсал, контур, чашки сегментные для бетона), (АГШК — алмазные «черепашки» из Кореи высшего качества, ФАТы — фрезы алмазные торцевые различных конфигураций по граниту и бетону), профильные фрезы для обработки камня. Алмазные сверла для мрамора, гранита и керамики (торцевые сверла, кольцевые сверла, сегментные сверла, сверла корончатые для УШМ.

     ELLY / ЭЛЛИ — наборы отрезных алмазных дисков, фрезы для производства фигурных профилей, различных пазов, выравнивания и калибровки, фреза для снятия фаски, профильная фреза, фреза для обработки камня. Корончатые сверла, диски для резки мрамора и гранита, диски сегмент, диски с фланцем, диск без фланца, диски с боковыми сегментами, диски с усиленным центром, алмазные диски для резки мрамора и гранита для ручных машин, диски для болгарок, хвостовик для диска.

     PROXXON, BOSCH, DREMEL (Проксон, Бош, Дремель) — бормашинка, шлифмашинка, электробормашинка, электрошлифмашинка по камню надежно недорого, гравировальная машинка, матовка для букв, портретная машинка, алмазная игла, вставка алмазная, ударная бормашинка, игла твердосплавная, компактная пила, диск для расшивки швов, углошлифмашина GWS 22-230 LVI, GWS 24-230 JVX, GWS 17-125 CIE V, УШМ, болгарка, плиткорез GCT 115, циркулярная пила 4101 RH, электролобзик по камню PGS 60 Set, полировальная шлифмашина, дельташлифмашина для резки и полировки камня, прямошлифовальная машина, перфоратор, технический фен (воздуходувка), алмазные сверла и коронки для мокрого сверления мрамора и твердой керамики, охлаждающая система (баллон для водяногоохлаждения алмазных сверел и коронок), переходник для коронки, центрирующая система для алмазных сверл, центрирующая система для алмазных коронок

     FLEX / ФЛЕКС — кантофрезеры LWW 1506 VR, LWW 2106 VR, циркулярная пила CS 60 Wet (с подачей воды), электрический профилеобразующий станок, машинка для бучардирования, оборудование для обработки бучардой, бучарда, шлифмашинка, разделяющий трансформатор TT 2000 , установка алмазного сверления (BED 18, BED 69), оборудование для работы с камнем, шина-направляющая, водонапорный баллон WD 10,  твердосплавная звездочка для LST, переходники для установки фигурных фрез на профилеобразующие машины (кантофрезеры) FLEX.

     MESSER / МЕССЕР — циркулярная пила SCS7, дрель для алмазного бурения по керамической плитке и натуральному камню TC-402.

     METABO / МЕТАБО, GALESKI / ГАЛЕСКИ — полирователь (УШМ) для интенсивной полировки гранита мрамора и других видов камней, масленка встраиваемая, углошлифмашина, УШМ, болгарка, алмазные пилки для лобзика, приспособление для калибровки и горизонтального пропила Gadia Trim. Влагоотделитель, сепаратор от производителя OMI / ОМИ. Приспособление для калибровки и горизонтального пропила GADIA TRIM.

     ZEC, SAIT / ЗЕК / САЙТ — абразивные шлифовальные круги для работы без водяного охлаждения — «Сайты», Сайтак, «Зеки», фибродиски, зекдиски, полужесткие абразивные круги, LOC-LINE / ЛОКЛАЙН — системы модульных гибких трубок для подачи СОЖ — смазочно-охлаждающей жидкости, в том числе вакуумные и кислотоустойчивые трубки.

     CEAM / ЧЕАМ — рашпили, пунктир-машинка, скарпели, троянки, шпунт, чертилка для камня алмазная и твердосплавная, спицы/стержни твердосплавные паяные, закольник для гранита, насадка для бучардирования, пневмомолоток, круги войлочные плотные недорого в наличии, насадки для полировки камня из натурального фетра, круги войлок для коленно-рычажных станков для гранита из первых рук, войлок с велкро липучкой мягкий и жесткий, овчина полировальная для камня, франкфурт войлочный для полировки гранита на колонке с креплением и без. Ткань полировальная прошитая для полировки мрамора болгаркой, фетр стальной нержавейка в кругах, в рукавах, в бубликах, салфетка из нержавейки для изделий из камня и металла. Пемза для полировки скульптур из мрамора, диск свинцовый для полировки темного гранита. Полимерная врезная полоса противоскольжения.

     AVA DIAM / АВА ДИАМ — приспособление для торцевого пропила, ЭМШУ, приспособление для снятия фаски на камне, прорезка пазов для капельников на подоконниках, ступенях и карнизах, выборка «четвертей» для сращивания плит, кантофрезер MAKITA на сплошной «водяной подушке» и на шаровых опорах для обработки боковых поверхностей из камня, портативная машина для фасонной обработки изделий из природного камня,

     COMPANY 3M / Компания 3М — клей-мастика TECTANE 2040, однокомпонентный полиуретановый клей-герметик для склеивания и герметизации, диск фетровый мягкий и диск фетровый жесткий для полировки камня, очки защитные 3M панорамные, вкладыши (беруши), респиратор противоаэрозольный от дисперсных аэрозолей с клапаном, противоаэрозольный фильтр, силиконовый респиратор-полумаска защита от органических паров, сменные патроны (фильтр) для полумаски для защиты дыхания, сменные патроны от органических паров, кислых газов и аммиака, серфильтр от пыли и туманов, держатель предфильтра, полиэстровый ПЭД, ПЭДы (ПАДы) для очистки поверхности от загрязнений, пэд (пад) снятия изношенного слоя защитного покрытия с каменных полов, пэд (пад) для влажной и сухой полировки камня, пэд (размывочный круг) – абразивный диск из нетканного волокна (полиэстер или полиамид) при помощи которого осуществляется очистка, глубокая размывка, полировка, натирка, шлифовка, кристаллизация напольных покрытий специальным уборочным оборудованием (одно- и многодисковых машин, а также для поломоечных машин), алмазный пэд (пад) SIENNA и PURPLE , клей-спрей 3М 90 (для ремонта суппортов и подклейки VELCRO), герметик краевой для запечатывания краев абразивных противоскользящих лент, бесцветный быстросохнущий герметик, мастика (герметик) Рабберфлекс. FIBRATESCO / ФИБРАТЕСКО абразивы для промышленного использования (полиэстровые пэды (пады), УНИ-ПАДЫ (УНИ-PAD), блок для затирки, очистки и полировки камня.

    Ручные плиткорезы и блокорезы фирмы  MONTOLIT / МОНТОЛИТ для резки всех видов плитки, плит и бетона, а также алмазные диски для резки камня на станках. Электрические плткорезы для резки плитки фирмы BATTIPAV / БАТТИПАВ, погружные насосы.

     Экологическое оборудование для очистки воздуха от пыли BORA и MISTRAL, а также для очистки воды от шлама.

    Изделия, буквы из бронзы для оформления памятников — CAGGIATI, Каджиати (Италия), Бронзовые буквы и цифры для памятников купить в Москве, Бронзовые буквы на памятник заказать с доставкой, оригинальные буквы Caggiati Италия. Буквы имеют классический бронзовый цвет. Купить кресты и распятия в Москве, рамки овальные и прямоугольные для памятников, цветы бронзовые и покрытые эмалью на памятник. Фурнитура и крепеж для памятников и портретов из бронзы Италия Каджати, Каджиатти.

     ООО «Компания АЛМИР» реализует в России современные материалы для укладки каменных и керамических плит (клеевой раствор SOPRO FF 455, двухкомпонентные клеи, эпоксидный состав для укладки и затирки, клеи для наклеивания плитки на основу и составы для заполнения швов,  сухие смеси для расшивки (затирки) швов, улучшенные специальные клеи и смеси предназначены для заполнения швов в напольной облицовке). Материалы для укладки каменных и керамических плит (шпатель, терка для очистки плитки от эпоксидных затирочных составов, миксер, щетки для мытья, моп, ручка-палка для сгона, сквидж, микроспан, карандаши для разметки по камню, защитная пленка от брызг во время ремонтных работ, скребок, ведра для мойки, валик и ванночка для краски, молоток (киянка) для брусчатки, киянка гранитчика, полоса из стекловолокна с пазами, распылитель для жидкостей, коннектор, брусок для вскрытия алмазных дисков, Средства противоскольжения (оборудование для термообработки гранита, газовая горелка, держак для газовой горелки, горелка для прожига полос на граните, полосы противоскольжения, абразивная противоскользящая полоса, фотолюминисцентная полоса противоскольжения), лубликаторное масло для пневматических инструментов для защиты пневмодвигателя от износа и коррозии, воздушный резиновый шланг, шланг маслобензостойкий, воздушный шланг нейлоновый, штуцеры для блока подготовки воздуха, переходники, соединители, струбцины, профессиональный пистолет для герметика, адааптеры и смесители для картриджей различных систем, коленно-рычажный шлифовально-полировальныц станок (колонок), широкий ассортимент аксессуаров для станков, расходного инструмента для полировки каменных плит на станках. Измерительный инструмент (рулетка, угольник, линейка, транспортир, кронциркуль, пунктировальная машина (циркуль для скульптур), весы, мерный стакан, цифровой угломер, лазерный дальномер, система измерений и проекции разметки, цифровой блескомер, линейный лазер). Спецодежда и средства защиты (перчатки ПВХ, химическистойкие перчатки, нарукавники, фартук камнеобработчика, плащ, костюм влагозащитный, защитные очки, наушники. беруши (вкладыщи), респираторпротивоаэрозольный, маска, каска строительная, наколенники,). Также у нас имеется в наличии печатная продукция о камне и его обработке.

     Сертифицированную продукцию этих производителей мы получаем непосредственно с фабрик по официальным контрактам. Самые востребованные товары этих производителей мы всегда держим на складе в достаточном количестве.

     Мы постоянно изучаем новые технологии и методики по обработке природного и искусственного камня, посещаем российские и международные выставки по каменной тематике. Наши специалисты проходят обучение на предприятиях наших партнеров — производителей инструмент, химии и станков для камня. В свою очередь мы сами проводим обучающие семинары и выступаем на конференциях по камнеобработке. Получить бесплатную консультацию по обработке мрамора, гранита и другого природного и искусственного камня это реально!

     Офис, склад и сервис находятся по одному адресу на юге Москвы, рядом со станцией метро Варшавская. Несколько наших фирменных автомобилей ежедневно делают доставку заказов по городу и области. Для отправки в другие города России у нас есть договора и понимание со всеми крупными курьерскими и транспортными компаниями.

     Заказать качественный инструмент и оборудование для обработки камня и купить химию для камня недорого с доставкой по Москве и России за наличный или безналичный расчет вы всегда можете в ООО «Компания АЛМИР». На все оборудование действует заводская гарантия, подтвержденная гарантийным талоном. Принимаем карты VISA и MASTERCARD, быстро оформляем все необходимые документы и отгружаем товар. Для удобства клиентов и борьбы с пробками мы также открыты и в субботу.

     Если вы работаете с камнем и у вас есть интересные и сложные задачи по его обработке — это к нам! Звоните — поможем!

Исключительная машина для обработки улиток с непревзойденными скидками

Обновите свой дом или бизнес с помощью изумительной и премиальной машины для обработки улиток , доступной на Alibaba.com с непревзойденными скидками. Улитка обладает выдающимися характеристиками, основанными на передовых технологиях и инновациях, которые позволяют создавать великолепные конструкции для достижения оптимальной производительности. Машина для улиток изготовлена ​​из прочных и долговечных материалов, которые обеспечивают длительный срок службы при постоянной эффективности.Они повышают эффективность, продуктивность и прибыльность пользователей.

Благодаря широкому выбору автоматов для улиток , обладающих различными функциями и характеристиками, покупатели любого типа гарантированно найдут идеальное соответствие их требованиям. Улитка доступна в различных размерах и мощности обработки, чтобы соответствовать различным производственным потребностям для бизнеса и частных лиц. Машина-улитка Продавцы на Alibaba.com проходят строгую проверку на соответствие всем стандартам качества.

Производители этих машин для улиток полны решимости способствовать устойчивости. Они используют хитроумные стили и методы, которые сводят к минимуму потребление электроэнергии, сохраняя при этом высочайшую эффективность. Воспользуйтесь этим замечательным атрибутом машины snail machine и сократите свои счета за электроэнергию. Ключевое слово { } включает в себя их инструкции по установке, а также правила безопасности, чтобы дать пользователям возможность сразу же воспользоваться их преимуществами после приобретения. Несмотря на эти правила, вы можете в любое время связаться с продавцами для получения дополнительной помощи.

Вы можете подумать, что множество желаемых функций обойдется вам в целое состояние. Напротив, они намного доступнее, чем вы думаете. Изучите множество автомат для улиток на Alibaba.com и насладитесь заманчивыми предложениями. Приобретите надежную машину для улиток сегодня и повысьте продуктивность дома или на работе.

Малая шлифовальная машина для раковин улиток

Молотковая дробилка для процессоров Sea Shell / Oyster Shell

4 августа 2016 г. Молотковая дробилка для процессоров Sea Shell / Oyster Shell Hello lm в настоящее время ищу машину, которая может удалить приготовленных улиток

Получить цену

потенциалов кальцинированной раковины гигантской африканской улитки — ResearchGate

18 марта, 2017 Раковины улиток — это отходы, обычно получаемые от смешивают с мелким порошком на коммерческой фрезерной машине. .. Пальмовое ядро ракушка известна своим аналогичным минеральным элементом с цементом и небольшим количеством

Получить цену

(Устрицы) Раковины в Нигерии — Журнал Выпуски

2 января 2015 г. водяная улитка, моллюск и барвинок были почти постоянными, размер несмотря на это. Прочность на раздавливание для всех размеров гильз. Доступные дробильные машины для мелких фермеров для измельчения скорлупы

Получить цену

Applesnail.net • Просмотр темы — Создание источника кальция из улитки

5 августа 2007 г. Измельчение: вам, конечно, нужно найти способ измельчить кожуру скорлупы в более мелкую вероятно из-за более крупных кусков, хотя и более мелких улиток, таких как

Получить цену

потенциалов кальцинированной раковины гигантской африканской улитки — ResearchGate

18 марта, 2017 Раковины улиток — это отходы, обычно получаемые от смешивают с мелким порошком на коммерческой фрезерной машине… Пальмовое ядро ракушка известна своим аналогичным минеральным элементом с цементом и небольшим количеством

Получить цену

Микрогеографические изменения прочности раковины плоского барвинка

Поскольку L. mariae созревает раньше и укрепляет скорлупу меньшего размера, по прочности снаряда; раковины у улиток, собранных с одного места, прочнее, чем у

Получить цену

Улитки в трех масштабах: взаимодействие гидрологии ручья и гидравлики

Генри Хорн и Том Доук щедро помогли с основным оборудованием и оборудованием, а также .В небольшом физическом масштабе твердые раковины улиток поддаются прекрасному Измерение — улитки сопротивляются раздавливанию раками, обычным хищником улиток. В очереди

Получить цену

Многофункциональная машина для измельчения раковин улиток / морских раковин

14 декабря 2016 г. Мощный шлифовальный станок для измельчения раковин улиток, морских раковин.

Получить цену

Прочная раковина улитки может создать лучший доспех — Live Science

18 января 2010 г. Раковина улитки имеет уникальную структуру, которая может дать подсказки для проектирования В надежде узнать, как именно панцирь чешуйчатой ​​улитки способен противостоять таким дробление, авторы. Твердый внешний слой содержит мелкие зернистые частицы.для средств защиты человека, от бронежилетов до спортивного снаряжения.

Получить цену

Прочная раковина улитки может создать лучший доспех — Live Science

18 января 2010 г. Раковина улитки имеет уникальную структуру, которая может дать подсказки для проектирования В надежде узнать, как именно панцирь чешуйчатой ​​улитки способен противостоять таким дробление, авторы. Твердый внешний слой содержит мелкие зернистые частицы. для средств защиты человека, от бронежилетов до спортивного снаряжения.

Получить цену

Эмпирические модели для оценки механических и морфологических

Раковина улитки размером 75, 125, 250 и 500 мкм массой была переносили в шаровую мельницу и оставляли в мельнице на 2 часа; .. изгиб прочность и энергия удара, полученные в композитах с меньшим размером частиц .

Получить цену

Эмпирические модели для оценки механических и морфологических

Раковина улитки размером 75, 125, 250 и 500 мкм массой была переносили в шаровую мельницу и оставляли в мельнице на 2 часа; . . изгиб прочность и энергия удара, полученные в композитах с меньшим размером частиц .

Получить цену

Многофункциональная машина для измельчения раковин улиток / морских раковин

14 декабря 2016 г. Мощный шлифовальный станок для измельчения раковин улиток, морских раковин.

Получить цену

(Устрицы) Раковины в Нигерии — Журнал Выпуски

2 января 2015 г. водяная улитка, моллюск и барвинок были почти постоянными, размер несмотря на это. Прочность на раздавливание для всех размеров гильз.. Доступные дробильные машины для мелких фермеров для измельчения скорлупы

Получить цену

Ограниченная пластичность: чрезмерно обобщенная — Semantic Scholar

хищников, которые обычно встречаются чаще, чем хищники, сокрушающие панцири. .. Цена плодовитости возникает из-за того, что более мелкие улитки менее плодовиты (например, МакМахон, 1975; .. MorphoSys: интерактивная программа машинного зрения для приобретения.

Узнать цену

Раковина раковины дает нано-понимание композитных материалов

25 марта 2011 г. Раковины морских улиток на 95% состоят из карбоната кальция. обнаруживают, что ключ к прочности раковины кроется в небольшом размере. снаряды достаточно прочные, чтобы выдержать до некоторой степени сокрушительные челюсти оборудование для плавки алюминия и электроэрозионной обработки,

Получить цену

Ресурсы улиток Восточного моря Берин9 и их промысел — NOAA

Центр рыболовства в 1975 г. (внутри пунктирной линии) и районы с высокой плотностью улиток.(все длина вида) вносят относительно небольшой вклад в общую биомассу улиток. состоит из измельчение скорлупы, кратковременное приготовление. машина для измельчения улиток и куплена.

Получить цену

Applesnail.net • Просмотр темы — Создание источника кальция из улитки

5 августа 2007 г. Измельчение: вам, конечно, нужно найти способ измельчить кожуру скорлупы в более мелкую вероятно из-за более крупных кусков, хотя и более мелких улиток, таких как

Получить цену

Sea Shell / Oyster Shell Processor Grinder Hammer Mill Machine

4 августа 2016 г. Молотковая дробилка для процессоров Sea Shell / Oyster Shell Hello lm в настоящее время ищу машину, которая может удалить приготовленных улиток

Узнать цену

Раковина раковины дает нано-понимание композитных материалов

25 марта 2011 г. Раковины морских улиток на 95% состоят из карбоната кальция. обнаруживают, что ключ к прочности раковины кроется в небольшом размере. снаряды достаточно прочные, чтобы выдержать до некоторой степени сокрушительные челюсти оборудование для плавки алюминия и электроэрозионной обработки,

Получить цену

Машина для наполнения поршневого насоса геля экстракта улитки

Машина для наполнения поршневого насоса с экстрактом улитки

Решения по товарному розливу

Spec

• Применение: Напитки, химические, пищевые, медицинские
• Тип привода: Электрический
• Диапазон заполнения: 10 ~ 1000 мл
• Скорость наполнения: 30 ~ 150 мл / сек (зависит от вязкости жидкости)
• Потребляемая мощность: 110 или 220 В переменного тока; однофазный
• Точность наполнения: ± 1%
• Требования к воздуху: 6 кгс / см2
• Размер: (Д) 350 мм (Ш) 350 мм (В) 1700 мм

Основные характеристики

FP-2000 удовлетворяет потребности в розливе в различных отраслях промышленности, включая пищевую, косметическую, химическую и т. Д.Его вертикальный дизайн обеспечивает большую экономию пространства. Бункер в верхней конструкции также помогает жидкостям с более высокой вязкостью перемещаться вниз к поршневому цилиндру. Короче говоря, FP-2000 станет отличным помощником для предприятий малого и среднего бизнеса с потребностями в заполнении жидкостей средней и высокой вязкости.

• Заливочная жидкость от средней до высокой вязкости (при условии тестирования продукта).
• Вертикальная конструкция обеспечивает эффективное использование пространства.
• Базовые ролики повышают мобильность.
• Регулируемые объемы наполнения.
• Легко собираемый поршневой цилиндр обеспечивает быструю очистку и легкое обслуживание.

Платежные реквизиты для офлайн-заказов

Последнее обновление: 2019-12-31 Загружается . ..

Ваш запрос отправлен

Шаг 1 Заполните форму Шаг 2 Завершение

г.Алекс , НЕОСТАРПАК КО., ЛТД.

Требуется сообщение 0 /1500

Форматы файлов: htm, html, doc, docx, pdf, txt, jpg, gif, png, odt, ods. Максимум 3 файла (всего 10 МБ).

Общий размер: 0

{{/если}} {{#ifCond ttLoginType 3}}

Подтвердите пароль

{{/ ifCond}} {{#if isLogin}} Просмотр и изменение {{/если}}

Порекомендуйте других поставщиков, если этот поставщик не отвечает.

Пожалуйста, заполните все обязательные поля.

ОК

Snail Mail Gnome — Подходит для пялец 4×4, 5×7 и 8×8 дюймов — дизайны машинной вышивки

Размер заархивированного файла будет указан ниже. ЭТО ЛЕГКАЯ ЗАЛИВКА.ВАША ТКАНЬ БУДЕТ ПРОЯВЛЯТЬСЯ.

Маленький 2,56 дюйма (ширина) x 3,85 дюйма (высота) (64,9 x 97,8 мм) петель
Средний 4,62 дюйма (ширина) x 6,96 дюйма (высота) (117,4 000 000 000 000 000 000 9000 x 176. 8 мм) │19655 стежков
0003 70003 (h) (131,3 x 197,9 мм) │22,651 стежка

ТРЕБУЕТСЯ: вышивальная машина и возможность переноса рисунка с вашего компьютера на машину для использования этого файла (a USB-накопитель работает хорошо).Этот список предназначен только для файла цифровой машины, а не для готового изделия.

Для машинной вышивки
Вы получите девять форматов … DST, EXP, HUS, JEF, PES, VIP и VP3. Мы не продаем / не поддерживаем другие форматы. Также для выкройки будет предоставлена ​​таблица ниток.

Поскольку эти товары представлены в цифровом формате, возврат средств невозможен.
Если вы выбрали неправильный тип файла или возникла проблема с полученным файлом … его можно повторно отправить в правильном формате.

Вы можете использовать эти файлы для создания предметов для личного пользования или для продажи, но вы не можете перепродавать или распространять дизайны.

Изменение размера или редактирование дизайнов не рекомендуется.
Мы не даем никаких гарантий качества дизайна, если вы каким-либо образом измените его.

Улитка Илона Маска в 14 раз быстрее, чем его сверлильные станки

Илон Маск хочет построить туннель через Лос-Анджелес, который будет стрелять в людей по всему городу со скоростью более ста миль в час, и все это за ничтожную цену в один доллар.

Богатым калифорнийцам очень понравилась эта идея. В четверг вечером Маск провел пресс-конференцию в храме Лео Бека, которая была заполнена состоятельными жителями района Бель-Эйр в Лос-Анджелесе и фанатами Маска, многие из которых пришли в шляпах SpaceX и толстовках Tesla, сообщает Wired. Маск, в свою очередь, опоздал на 30 минут, обвинив в пробках 405-ю, и сел рядом с талисманом своей компании, улиткой.

Подразумевалось, что если бы Loop уже был построен — амбициозный проект, который он реализует в рамках своего новейшего предприятия, Boring Company, — он бы успел.Что касается улитки: он надеется, что его новая конструкция станка для сверления отверстий поможет реализовать этот проект. Прямо сейчас Улитка Гэри движется в 14 раз быстрее, чем машина Маска.

«Итак, мы действительно хотим быть быстрее улитки, что намного сложнее, чем кажется», — сказал Маск.

Наследник космоса и технологий хочет построить относительно небольшую версию Петли, двухмильного туннеля, недалеко от перевала Сепульведа в Лос-Анджелесе. Если он сработает, он перебросит людей туда и обратно за десять минут. И, в конце концов, Маск хочет оснастить весь город обширной сетью туннелей, по которым люди будут перемещаться по Лос-Анджелесу в масштабе, аналогичном полноценной системе метро, ​​которой в Лос-Анджелесе нет.

Учения могут быть медленными, но процесс утверждения города продвигается быстро. Правительство Лос-Анджелеса и доверчивые богатые сторонники Маска так взволнованы проектом, что комитет общественных работ городского совета Лос-Анджелеса проголосовал за то, чтобы не проводить экологическую экспертизу проекта.

Общественные группы, однако, не так взволнованы. Двое из них, Коалиция жителей Брентвуда и Коалиция Сансет, подали в суд за отказ от длительного, но тщательного процесса экологической экспертизы.

Но Маск в четверг настаивал на том, что беспокойство сообщества неуместно. «Вы даже не подозреваете, что мы существуем», — сказал Маск. «Если мы не можем проложить двухмильный туннель, не потревожив людей, как мы сможем преодолеть сотни миль?»

Сотни миль, о которых он говорит, конечно же, — это Hyperloop, его грандиозный план для межгородских путешествий с подобными подземными трубами, которые будут качать людей туда и обратно на почти сверхзвуковой скорости. Маск, по-видимому, вел переговоры с Белым домом о строительстве проекта Hyperloop на Восточном побережье, между Нью-Йорком и Д.В. — Чтобы добраться между городами в трубчатой ​​системе Маска, потребовалось бы всего 30 часов, а сейчас поездка на машине занимает около пяти часов.

Помимо экологических проблем, члены сообщества говорят, что у них нет информации о том, как город будет гарантировать, что Маск будет поддерживать низкие цены на доступ к Loop.

«Это туннель для богатых, а кирпичи для бедных», — сказала VICE News Венди-Сью Розен, президент Коалиции жителей Брентвуда, имея в виду план Маска делать кирпичи из земли, которую он выкапывает из туннелей.Розен сказал, что ее не пригласили на встречу в четверг, и ей пришлось подтолкнуть организаторов вообще допустить ее на встречу.

«Это вопрос собственного капитала», — добавил Розен. «Кому на самом деле будет разрешено пользоваться этим туннелем? Для кого строится этот туннель? »

Город, однако, кажется полностью готов к прыжкам в петлю. В прошлом месяце транспортная администрация Лос-Анджелеса опубликовала в Твиттере заявление, в котором говорилось, что они были «партнерами» компании Маска и работали над тем, чтобы Loop не помешал его собственным планам по строительству новых железнодорожных линий.

Все это предприятие финансировалось с использованием характерного для Musk pizazz. Генеральный директор, который недавно запустил в космос собственную машину, продал огнеметы для финансирования Boring Company.

Объявив в четверг, что скоро он будет предлагать частные тестовые поездки на Loop, как только он заработает, он сказал: «Это будет похоже на странную маленькую поездку Диснея в центре Лос-Анджелеса. Принеси свой огнемет.

Спрос на натуральную косметику стал причиной бума улиток в Италии | Окружающая среда | Все темы от изменения климата до сохранения | DW

Как и les escargots во Франции, выращивание улиток в Италии раньше было связано с гастрономией.Но за последние два года в итальянских аптеках и парфюмерных магазинах наблюдается рост интереса к продуктам на основе слизи. Этот натуральный ингредиент становится все более популярным — от кремов для лица против морщин до детских сиропов от кашля и антацидов.

«Более 20 лет они производят продукты из слизи улиток», — говорит Симоне Сампо, президент Международного института разведения улиток в Кераско, на северо-западе Италии. «Но за последние шесть месяцев потребление увеличилось более чем на 40 процентов.«

Сампо, занимающийся разведением улиток в течение последних 21 года, в восторге от бума слизи.« Все больше и больше людей открывают для себя этот продукт из-за его невероятных преимуществ для кожи, дыхательной системы и желудка », — говорит он.

Улитковые фермы, подобные этой в Кераско, начали сбор слизи улиток, чтобы удовлетворить растущий спрос

Слизистое откровение

О пользе слизи улиток, возможно, было хорошо известно в древние времена, но ее повторное открытие относится к 1980-е гг.Чилийские фермеры, разводящие улиток, направляющиеся на французский рынок, заметили, насколько мягкой и хорошо увлажненной стала кожа на их руках, и заметили, что порезы и шрамы быстро заживают.

Исследования подтвердили, что слизь улитки от природы богата витаминами, белками и такими веществами, как гликолевая кислота, аллантоин, коллаген и эластин, которые являются популярными ингредиентами в косметике.

Последовавший за этим рост спроса на слизь неизбежно привел к буму выращивания улиток. За последние 20 лет разведение улиток стало популярным, и количество ферм увеличилось втрое.

Улитки выделяют слизь, когда двигаются, и когда они испытывают удовольствие или страх . Институт охватывает все аспекты разведения улиток, от природы до гастрономии, от науки до экономики.

Только в одном районе Кераско насчитывается восемь хозяйств по выращиванию улиток и около 4000 ферм в сети заводчиков по всей Италии.Все они придерживаются философии института естественного разведения на открытом воздухе: никаких теплиц и кормов для животных, только свежие растения.

Поле на ферме Моники Фиссоре, в 50 км к югу от Турина

«Улитки любят подсолнухи», — говорит местная селекционерка Моника Фиссоре, которая создала свою ферму Il giardino della lumaca (Сад улиток) четыре года назад. У нее более миллиона улиток, и она кормит их цветами и овощами, а все дополнительные продукты она сама выращивает по периметру фермы.

До недавнего времени улитки Фиссоре предназначались для употребления в пищу, но теперь она начала продавать их для добычи слизи.

Институт разведения улиток регулярно проводит бесплатные вводные семинары для потенциальных фермеров, выращивающих улиток, и 80 имеющихся мест неизменно заполняются. Участники приезжают со всей Европы, а также из Австралии, Южной Африки, Латинской Америки и Ближнего Востока.

Извлечение слизи

Симоне Сампо почти десять лет исследовала лучший способ извлечения слизи, не причиняя вреда улиткам.

«Раньше они поливали их солью или уксусом, стимулируя улиток производить слизь, но также убивая их сразу же после этого», — объясняет Сампо, добавляя, что процесс экстракции не только убивал улиток, но и приводил к гораздо более низкой концентрации мукополисахаридов в слизи, чем обычно вырабатывается улиткой, когда она чувствует себя хорошо «.

Сотрудники института разработали безжалостный метод извлечения слизи из брюхоногих моллюсков

Мукополисахариды, такие как гиалуроновая кислота, естественным образом присутствуют в соединительной ткани и важны для увлажнения и смазки.Сампо пришел к выводу, что счастливые улитки производят более качественную и насыщенную слизь. «Моя идея заключалась в том, чтобы предотвратить страдания улитки и создать машину, которая бы избегала заражения и позволяла извлекать из одних и тех же улиток более одного раза».

Машина, к которой в конечном итоге пришла его команда, называется MullerOne, названная в честь разновидности улиток Helix Aspersa Müller. Металлическая конструкция имеет два купола из оргстекла, под которыми можно разместить 1500 улиток. Двадцать килограммов улиток производят примерно три литра слизи за один час процесса экстракции.

Улиток обрабатывают озоновым душем внутри MullerOne

«Спа для улиток»

В течение первых получаса улиток опрыскивают озоном, чтобы расслабить и очистить их от бактерий и плесени. В течение второго получаса их опрыскивают еще одним натуральным спреем, который стимулирует образование слизи.

Согласно Сампо, улитки производят слизь по трем причинам: движение, страх и удовольствие. Он утверждает, что вода, насыщенная озоном, дает им чувство благополучия, а стимулирующий лосьон — ощущение удовольствия.«Мы рассматриваем эту машину как спа для улиток», — лукаво говорит Сампо, который говорит, что одних и тех же улиток можно безопасно использовать для более чем одной добычи в день.

Слизь проходит через поддон для капель, спускается по воронке в стерильный контейнер, готовый к продаже. «С помощью нашей машины мы извлекаем незагрязненную, стандартизированную, не подвергающуюся жестокому обращению слизь», — с гордостью говорит Сампо. Он настолько уверен в слизи, извлеченной с помощью MullerOne, что институт теперь запустил собственную линию косметических средств на основе слизи, а также сиропа от кашля и жидкого антацида.

Сампо говорит, что институт MullerOne стимулирует улиток производить слизь, не причиняя им вреда

Преодоление отвращения

Менеджер по связям с общественностью института Сара Борио признает, что у потребителей часто возникают проблемы с идеей проглотить слизь улитки или втирать ее в кожу. их кожа, но она считает, что желание использовать натуральные, а не химические продукты помогает людям преодолеть фактор «эй».

«Потребитель больше осведомлен о том, что он ест, что наносит на лицо, на тело, поэтому рынок этих натуральных продуктов растет, а также есть место для слизи улитки», — говорит она.

Их ассортимент кремов и лосьонов содержит минимум 70-90 процентов слизи улитки, эффективно заменяя обычное содержание воды. Но она предупреждает потребителей остерегаться вводящего в заблуждение маркетинга:

«В Италии есть несколько продуктов, которые заявляют, что содержат слизь улитки, но процент действительно низкий», — говорит Борио, советуя потребителям избегать продуктов, в которых указан «экстракт слизи улитки» и выбрать те, которые явно содержат «слизь улитки».

• Это жизнь слизня

  Кто-то наблюдает за вами

  А может, и нет…. слизняки имеют форму глазных пятен на конце выдвигающихся оптических щупалец. Хотя они не могут определять цвет или форму, они чувствительны к свету, могут вырасти снова в случае повреждения и обладают многозадачной способностью обнаруживать запах. Полезно, учитывая, что только 5 процентов огромной популяции слизней одновременно находятся над землей.

• Это жизнь слизня

  Поймали с поличным

  Слизни — гермафродиты, которые спариваются, окружая друг друга и обмениваясь спермой.У некоторых видов, например у ярко-желтого бананового слизняка, пенис, длина которого может достигать шести дюймов, может застрять внутри тела партнера. Эта досадная дилемма разрешается апофализацией — практикой, при которой партнер или владелец застрявшего члена отгрызают его до упора.

• Это жизнь слизня

  Гигантская семья

  Через несколько дней после спаривания слизняк откладывает где-то от 20 до 100 яиц в земле, где они могут оставаться бездействующими в течение многих лет, ожидая идеальных условий для вылупления.Поскольку они откладывают яйца несколько раз в год, было подсчитано, что одна слизня может стать прародителем до 90 000 потомков. Но поскольку они не живут группами, они могут никогда не узнать свою маму или папу.

• Это жизнь слизня

  Мокрый, мокрый, мокрый

  Слизни, изначально живущие в море, нуждаются во влаге. И много всего. Их идеальная среда обитания — влажная тьма живых изгородей, компостных кучек или гниющего дерева. Если в теплую погоду не удается найти ничего подходящего, эти новаторские маленькие выжившие могут укрыться в бумажной конструкции, напоминающей кокон, прикрепляя ее к стене или дереву до тех пор, пока не пройдет тепло.

• Это жизнь слизня

  Поднимите подбородок

  При всей своей эволюционной утонченности, слизняки ненавидят садоводы и фермеры, которые жадно делятся советами о том, какой способ убить их — соль, пиво или токсичные гранулы. Хотя они регулярно становятся жертвами всех методов, представленных на рынке, слизни продолжают в изобилии скользить по миру. Подсчитано, что кубический метр влажного сада вмещает до 200 особей.

• Это жизнь слизня

  Jaws junior

  Слизни не привередливы в том, что они едят, и довольствуются практически всем удобоваримым, с которым они сталкиваются в своих скользких путешествиях. Сюда входят растения, компост, грибы и, в некоторых случаях, падаль или использованный корм для кошек. Если у вас создалось впечатление, что слизни беззубые существа, пора разочароваться. У них целых 27000 зубов — даже больше, чем у акул.

• Это жизнь слизня

  Эласта-слизня

  Пули двигаются за счет сокращения мышц на своей нижней стороне и выделения слизи, которая позволяет им скользить. Они защищаются от хищников, таких как ежи, змеи, жабы и птицы, сжимаясь, чтобы стать круглыми и твердыми, и в то же время прочно прикрепиться к своей поверхности.Когда берег чист, они также могут растягиваться в несколько раз больше своей нормальной длины.

• Это жизнь слизня

  Из любви к слизи

  Хорошо, мы, люди, считаем слизь слизью довольно неприятной, но для существ, которые ее производят, это их спасательный круг. Это не только помогает им передвигаться, но и защищает их кожу от острых краев, таких как острые как бритва осколки стекла. Довольно инновационный. Слизняк также водостойкий, поэтому его трудно удалить.Итак, слизняк смеется последним.

  Автор: Тэмсин Уокер

Механизм метилирования ДНК Biomphalaria glabrata демонстрирует пространственную экспрессию в тканях, по-разному активен в разных популяциях улиток и модулируется взаимодействиями с Schistosoma mansoni

Образец цитирования: Гейер К.К., Ниази У. Х., Дюваль Д., Коссо С., Томлинсон С., Чалмерс И. В. , и другие. (2017) Аппарат метилирования ДНК Biomphalaria glabrata демонстрирует пространственную тканевую экспрессию, дифференциально активен в разных популяциях улиток и модулируется взаимодействиями с Schistosoma mansoni .PLoS Negl Trop Dis 11 (5): e0005246. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246

Редактор: Пауло Филемон Пимента, Fundaçao Oswaldo Cruz, БРАЗИЛИЯ

Поступила: 20 апреля 2016 г . ; Принята к печати: 10 декабря 2016 г .; Опубликовано: 16 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Geyer et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Проект получил финансовую поддержку из гранта BBSRC, предоставленного KFH (BB / K005448 / 1), схеме BQR Университета Перпиньяна (проект SickSnail; CG), а также частично поддерживался грантом NIH RO1AI015503 (TPY). Мыши, инфицированные S. mansoni, были предоставлены TPY Центром ресурсов по шистосомозу NIAID (Институт биомедицинских исследований, Роквилл, Мэриленд) через контракт HHSN272201000005I NIH-NIAID для распространения через BEI Resources. Создание данных РНК-Seq B. glabrata в Институте генома Макдоннелла при Вашингтонском университете было поддержано грантом NIH HG003079. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Шистосомоз является вторым по значимости паразитарным заболеванием человека на планете, где риску заражения подвергаются более 200 миллионов человек и примерно 200 000 смертей в год [1].Это разрушительное и хроническое заболевание, вызываемое плоскими червями-трематодами, является эндемическим заболеванием в 78 странах тропических и субтропических регионов, при этом большинство случаев заболевания происходит в странах Африки к югу от Сахары [1]. Распространенность шистосомоза зависит от географического ареала восприимчивых видов улиток, которые служат обязательным промежуточным хозяином паразита. Три рода легочных улиток: Bulinus , Oncomelania и Biomphalaria , представляют собой наиболее важных промежуточных хозяев важных с медицинской точки зрения видов шистосом ( Schistosoma haematobium , Schistosoma japonicum и Schistosoma mansoni Schistosoma, соответственно).Антропогенная деятельность, такая как строительство плотин или разработка ирригационных систем, обычно является причиной роста популяции этих улиток [2, 3] и, следовательно, приводит к распространению этой забытой тропической болезни в ранее незатронутые регионы. Высокая репродуктивная способность этих одноядных улиток и их устойчивость к колебаниям температуры [4] являются дополнительными факторами, способствующими дальнейшему распространению в новых географических ареалах. Действительно, Biomphalaria spp .недавно были обнаружены на Украине [5], а также в Румынии [6] и Bulinus sp . был зарегистрирован на Корсике [7]. Это распространение на север в более умеренный климат, вероятно, ускорится, основываясь на прогнозах глобального изменения климата, тем самым способствуя распространению паромной болезни [8,9].

Несмотря на успех промежуточного уничтожения хозяина в ограниченных эндемичных по шистосомозу районах с помощью химических [10] или биологических [11–13] мер, широкомасштабное искоренение было трудно осуществить [14].В отсутствие профилактической вакцины и проблем, связанных с поддержанием однокомпонентной антишистосомной химиотерапии [15,16], будущее комплексной борьбы с шистосомозом будет все больше зависеть от разработки новых стратегий для устранения промежуточного хозяина. Однако для достижения этой цели срочно необходимо более глубокое понимание биологии и молекулярных процессов промежуточного хозяина [17].

У многоклеточных животных эпигенетические процессы, такие как те, которые облегчаются метилированием ДНК, играют важную и общепризнанную роль в основных биологических явлениях, включая развитие, стабильность генома и фенотипическую пластичность [18,19].В то время как наше текущее понимание метилирования ДНК было изменено исследованиями позвоночных, вероятно, существуют значительные различия в сохранении и функции основных компонентов механизма метилирования ДНК у беспозвоночных; они медленно распутываются по типам [20–23]. Внутри моллюсков роль метилирования ДНК была тщательно исследована только у экономически важной тихоокеанской устрицы Crassostrea gigas [24], где недавно было обнаружено, что внутригенные области умеренно экспрессируемых генов и производных мобильных генетических элементов преимущественно являются мишенью этого эпигенетического механизма. [25].Расширение исследований метилирования ДНК на другие виды моллюсков улучшило бы наше понимание этого важного эпигенетического процесса внутри филума.

Здесь, в связи с биомедицинской важностью шистосомоза и необходимостью дальнейшего понимания молекулярной биологии промежуточного хозяина, ответственного за передачу болезни, мы охарактеризуем основные компоненты аппарата метилирования ДНК, обнаруженные в пределах B . glabrata геном. Идентифицированные компоненты включают поддерживающую ДНК-метилтрансферазу (BgDNMT1), ДНК / тРНК-метилтрансферазу (BgDNMT2) и белок метил-CpG-связывающего домена (BgMBD2 / 3).Обнаружение активности DNMT и MBD в двух разных B . glabrata подтверждают, что эти основные компоненты аппарата метилирования ДНК являются функциональными, с BgDNMT1 / BgDNMT2, вероятно, ответственными за модификации 5-метилцитозина (5mC), наблюдаемые здесь, в дополнение к предыдущим исследованиям [26,27]. Транскрипция BgDNMT1 и BgMBD2 / 3 повышается в тканях гонад, а также в ответ на S . mansoni паразитарных продуктов, что указывает на роль этого эпигенетического процесса как в размножении улиток, так и во взаимодействиях с паразитами.5-азацитидин опосредованное ингибирование B . glabrata яйцекладка дополнительно подтверждает физиологическую роль метилирования ДНК в репродуктивной биологии. Новые антишистосомные стратегии, направленные на эти компоненты механизма метилирования ДНК, ждут дальнейших исследований в качестве элемента будущих комплексных усилий по борьбе с шистосомозом.

Материалы и методы

Биомфалария глабрата

Несколько разных B . Изоляты glabrata (Bg), использованные в этом исследовании, включают штамм NMRI (Военно-морской институт медицинских исследований), штамм BB02 ( B iomphalaria из Баррейро, Бразилия, пойманный в 2002 г.), штамм BgBRE, образцы которого первоначально были взяты в Ресифи в 1975 (Бразилия), и пигментированная гибридная линия, полученная из лаборатории профессора Майкла Денхоффа (Ноттингемский университет), полученная путем скрещивания множества известных чувствительных изолятов (Bg-Swansea, Bg-Brazil, Bg-Egypt и Bg-Belo Horizonte).Улитки Bg-Суонси (происхождение неизвестно) были получены в начале 1990-х от доктора Б. Джеймса из Университета Суонси. Улитки Bg-Belo Horizonte были первоначально собраны в Белу-Оризонти (1967) В. Хаасом (Университет Эрлангена, Германия). Улитки Bg-Egypt (происхождение неизвестно) были получены из Института медицинских исследований Беринга в 1980 году. Улитки Bg-Brazil были собраны в Бразилии в начале 1970-х годов и получены от полковника В. Радке.

Обозначение

B . glabrata Гомологи DNMT и MBD

Во всю длину B . glabrata Гомологи DNMT и MBD были предсказаны путем выполнения tBLASTn-поиска генома улитки v4.3 с использованием диапазона DNMT ( Mus musculus DNMT1 — GenBank: P13864.5, Apis mellifera DNMT1 — GenBank: NP_00_ Ciona Кишечник, DNMT1 — XP_002122948.1) и MBD ( Aplysia californica —GenBank: XP_005103642.1, Crassostrea gigas MBD2 / 3 — GenBank: EKC32831.1)). Экзон-интронные структуры Lottia gigantea DNMT1 (имя транскрипта: 114987), DNMT2 (имя транскрипта: 119453) и MBD2 / 3 (имя транскрипта: 112523; все [28]) были использованы для завершения B . glabrata генных структур.

Б . glabrata клонирование машины метилирования ДНК

Два дня натощак, лабораторно выведенные образцы штамма NMRI препарировали и впоследствии выделяли РНК с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. После обработки ДНКазой (Ambion) 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием случайных гексамерных праймеров и SuperscriptIII (Invitrogen). Пары олигонуклеотидов (таблица S1), разработанные на основе предсказанных последовательностей, были использованы для амплификации полноразмерных (ATG для остановки) последовательностей BgMBD2 / 3 (729 п.н.) и BgDNMT2 (1182 п.н.) из кДНК, полученной из головы / стопы человека. Улитка NMRI.Затем продукты ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) перед секвенированием. В случае BgDNMT1 продукт размером 1652 п.н. (содержащий каталитический домен на его С-конце) был амплифицирован и подвергнут клонированию вектора pGEM-T Easy, а также секвенированию ДНК. После подтверждения последовательности транслируемые последовательности BgDNMT1, BgDNMT2 и BgMBD2 / 3 были впоследствии отправлены на поиск домена Pfam [29], и идентифицированные домены BgDNMT1 (PF12047, PF02008, PF01426, PF00145), BgDNMT2 (PF00145) и BgMBD (PF01429, PF14048) экстрагировали. Кроме того, наличие сигнала ядерной локализации (NLS) в пределах ORF BgDNMT1 было исследовано и подтверждено с помощью cNLS mapper [30].

Выравнивание последовательностей и филогенетический анализ

Множественные выравнивания последовательностей BgDNMT1, BgDNMT2 и BgMBD2 / 3 были получены с использованием MUSCLE v3.8 [31]. Каталитический домен (PF00145) BgDNMT1 и BgDNMT2 был сопоставлен с последовательностями следующих организмов (номер доступа в GenBank): A . Калифорния DNMT2 (XP_005095276.1), Л . gigantea DNMT2 (расшифровка названия: 119453 [28]), Capitella teleta DNMT2 — ELU13416.1, Helobdella robusta DNMT2 (расшифровка названия: 89038 [28], S . DNMSONI . ), A . mellifera DNMT2 (XP_393911.3), M . musculus DNMT2 (AAC53529), A . californica DNMT1 (XP_005104649.1 9017. gigantea DNMT1 [28], C . телета DNMT1a (ELT93682. 1), H . robusta DNMT1 (расшифровка: 116156 [28]), A . mellifera DNMT1 (NP_001164522.1) и M . musculus DNMT1 (P13864.5). В случае BgMBD2 / 3 выравнивание было выполнено с использованием следующих последовательностей (номер доступа GenBank): A . Калифорния (XM_005103585.1), L . gigantea MBD2 / 3 (расшифровка названия: 112523 [28]), C . гига MBD2 / 3 (EKC32831.1), H . robusta MBD2 / 3 (расшифровка: 185546 [28]), C . телета MBD2 / 3 (ELT95247.1), S . mansoni (HM9), Paragonimus westermani MBD2 / 3 [32], S . japonicum MBD2 / 3 (AAW26585.1), Hymenolepis microstoma MBD2 / 3 [32], Echinococcus multilocularis MBD2 / 3 [32], Echinococcus granulosus DNMT2 [32enia], DNMT2 [32enia], DNMT2 [32enia], [32], Schmidtea mediterranea MBD2 / 3 [32], Hemicentrotus pulcherrimus MBD2 / 3 (EU5

), M . musculus MBD2 (NP_034903), M . musculus MBD3 (NM_013595).

Для филогенетического анализа BgMBD2 / 3, BgDNMT1 и BgDNMT2 на основе байесовского (MrBayes v3.1.2 [33]) подходов и подходов максимального правдоподобия (MEGA v5.2.2 [34]) аминокислотные последовательности были выровнены с использованием MUSCLE v3.8 [31] ]. Шесть высококонсервативных мотивов в каталитическом домене (PF00145) BgDNMT2 и BgDNMT1 были выровнены с последовательностями из (номер доступа в GenBank): A . Калифорния DNMT2 (XP_005095276.1), Л . gigantea DNMT2 (расшифровка: 119453 [28]), C . телета DNMT2 (ELU13416.1), H . robusta DNMT2 (расшифровка: 89038 [28]), C . кишечник DNMT2 (XP_002128135.1), M . musculus DNMT2 ( AAC53529.1), S . mediterranea DNMT2 [32], E . multilocularis DNMT2 [32], S . mansoni DNMT2 (HM9. 1), Fasciola hepatica DNMT2 [32], A . mellifera DNMT2 (XP_393911.3), Culex quinquefasciatus DNMT2 (XP_001867327.1), C . кишечник DNMT3a (XP_002123461.1), M . musculus DNMT3a (O88508.2) M . musculus DNMT3b (O88509.2), H . robusta Dnmt3 (расшифровка: 162653 [28]), A . mellifera DNMT3 (NP_001177350.1), L . gigantea Dnmt3 (расшифровка названия: 171288 [28]), Bombyx mori DNMT1 (NP_001036980.1), A . mellifera DNMT1 (NP_001164522.1), H . robusta DNMT1 (расшифровка: 116156 [28]), A . калифорнийская DNMT1 (XP_005104649.1 [28]), C . телета DNMT1a (ELT93682.1), L . гигантея DNMT1 [28], C . кишечник DNMT1 (XP_002122948.1) и M . musculus DNMT1 (P13864.5). Для филогенетического анализа BgMBD2 / 3 использовали выравнивание аминокислотных последовательностей следующих последовательностей MBD (номер доступа в GenBank): Clonorchis sinensis MBD2 / 3 [32], Opisthorchis viverrini MBD2 / 3 [32], S . mansoni (HM9), P . Вестермани MBD2 / 3 [32], S . japonicum MBD2 / 3 (AAW26585.1), F . hepatica MBD2 / 3 [32], E . multilocularis MBD2 / 3 [32], E . granulosus DNMT2 [32], Taenia solium MBD2 / 3 [32], H . микростома MBD2 / 3 [32], S . mediterranea MBD2 / 3 [32], Macrostomum lignano MBD2 / 3 [32], H . pulcherrimus MBD2 / 3 (EU5

), A . Калифорния (XM_005103585.1), L . gigantea MBD2 / 3 (расшифровка названия: 112523 [28]), C . гига MBD2 / 3 (EKC32831.1), C . телета MBD2 / 3 (ELT95247.1), Xenopus laevis MBD3 (BAC22082.1), M . musculus MBD3 (NM_013595), X . laevis MBD2 (NP_001083787.1), M . musculus MBD2 (NM_010773), X . laevis MBD1 (NP_001104183. 1), M . musculus MBD1 (NM_013594), X . laevis MeCP2 ( AAD03736.1), М . musculus MeCP2 (NM_010788), Xenopus tropicalis MBD4 (NP_001037916) и M . musculus MBD4 (NM_010774). В случае гомологов MBD неоднозначно выровненные области удаляли с помощью Gblocks v0.91b [35]. Анализ максимального правдоподобия был проведен с использованием модели замещения Джонса-Тейлора-Торнтона (JTT) и 500 повторностей начальной загрузки. Байесовские выводы были рассчитаны с использованием модели замещения WAG, в которой выполнялись четыре независимых прогона цепи Маркова методом Монте-Карло для 1 000 000 поколений.Графический вывод финальных байесовских консенсусных филограмм был затем получен с помощью Figtree v1.3.1 [36], а дальнейшие ручные аннотации были сделаны в Adobe Illustrator v13.0.2.

RNA-Seq: выделение РНК, подготовка библиотеки и секвенирование

Во-первых, разнообразный набор тканей, в том числе белковая железа (AG), щечная масса (BUC), центральная нервная система (ЦНС), пищеварительная железа / гепатопанкреас (DG / HP), голова / стопа (FOOT), сердце / орган, продуцирующий амебоциты. (HAPO), почка (KID), край мантии (MAN), яйцеклетки (OVO), слюнные железы (SAL), желудок (STO) и терминальные гениталии (TRG) были вырезаны у взрослых особей B . glabrata BB02, полученный из 4–5 отдельных улиток. После этого общую РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen), а затем обрабатывали ДНКазой в соответствии с протоколом производителя (Ambion). Поли (А) + РНК выделяли из тотальной РНК (набор Ambion MicroPoly (A) Purist), проверяли качество с помощью биоанализатора Agilent 2100 (оценка RIN = 7-8) и использовали для создания ненормализованной библиотеки кДНК с помощью NuGEN Ovation. Система РНК-Seq V2 (NuGEN). Наконец, каждую библиотеку кДНК секвенировали на приборе Illumina HiSeq (~ 36 ГБ на дорожку).Необработанные чтения RNA-Seq каждого образца доступны в репозитории NCBI BioProject (PRJNA12879).

RNA-Seq: Контроль качества и анализ дифференциальной экспрессии

Перед картированием необработанных данных последовательности, последовательности адаптера и праймера были удалены из считываний парных концов Illumina с помощью FASTX-Clipper [37], а проверка контроля качества была выполнена с помощью FastQC [38]. После этого чтения были сопоставлены с B . glabrata геномных каркасов, доступных на VectorBase [39] с TopHat2 [40].Впоследствии для вызова SNP / INDEL была использована программа Samtools mpileup [41], и обнаруженные варианты были отфильтрованы по качеству, как ранее описано в Jia et al . [42]. Матрица нормализованного подсчета экспрессии генов была создана с использованием языка статистического программирования R v3.1.2 [43], пакетов Bioconductor GenomicRanges и GenomicAlignments [44], а также DESeq2 в соответствии с протоколом Андерса и его коллег [45]. DESeq2 также использовался для проведения анализов дифференциальной экспрессии (пороговые значения включали 10% ложное обнаружение [46] и минимальное log ₂ -кратное изменение 1 среди различных типов тканей улитки [45]).

RNA-Seq: Сеть аннотаций и ассоциаций генов

Используя BLAST2GO [47], термины генной онтологии (GO) [48] были отнесены к дифференциально экспрессируемым транскриптам, а отношения между генами были представлены в виде сети, в которой узел (вершина) представляет ген, а линия (край), соединяющая два гена. представляет соседей [49]. Используя библиотеку igraph [50] в R [51], дифференциально экспрессируемые гены были представлены в виде графика. Два гена связаны (т. Е.были соединены линией), если они разделяли категорию GO-терминов «Биологический процесс» и их профили экспрессии коррелировали (0,6 ≤ Корреляция Пирсона ≤ -0,6).

Подтверждение qRT-PCR данных RNA-Seq

Образцы из AG, STO, FOOT, DG / HP и OVO были препарированы с 3-4 улиток BgBRE под бинокулярным диссекционным микроскопом (три биологических повтора для каждой ткани). Гемоциты 10 улиток собирали из гемолимфы после центрифугирования при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 ° C.Затем суммарную РНК выделяли из пяти различных тканей и гемоцитов с использованием TRIzol Reagent (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. После этого образцы РНК (10 мкг) обрабатывали ДНКазой (Ambion) и 1 мкг подвергали обратной транскрипции с использованием случайных гексамерных праймеров и обратной транскриптазы Revertaid H минус M-MuLV (Fermentas). Затем qRT-PCR выполняли на кДНК (разбавленных в 20 раз водой, свободной от нуклеаз), используя Light Cycler System 480 (Roche). Последовательности праймеров, используемые для амплификации Bgmbd2 / 3 (BgMBD2 / 3 qRT-PCR1), рибосомного белка BgS19 и Bgdnmt1 , можно найти в таблице S1.Значения Ct генов-мишеней были нормализованы до уровня транскрипта эталонного гена BgS19 (GenBank: CK988928) с использованием метода Pfaffl, как описано в Chalmers et al . [52]. Каждый эксперимент qRT-PCR проводился по крайней мере дважды, и биологические дубликаты использовались для каждой ткани, а технические трижды выполнялись для каждой реакции qRT-PCR. В случае гемоцитов использовали технические дубликаты одного образца.

Обработка 5-азацитидином (5-AzaC)

B . glabrata улитки

NMRI B . glabrata улиток (размером 1–1,2 мм) содержали в искусственной пресной воде (0,378 мМ CaCl ₂ , 0,5 мМ MgSO ₄ -7H ₂ O, 0,025 мМ K ₂ SO ₄ , 0,5 мМ NaHCO ₃ , 0,0002 мМ FeCl ₃ -6H ₂ O в деионизированной воде) в присутствии (491 мкМ) или в отсутствие деметилирующего агента 5-AzaC (Sigma) при 28 ° C в течение восьми дней. Было проведено два повторных эксперимента (первый эксперимент = 10 улиток / состояние; второй эксперимент = 12 улиток / состояние) с заменой 5-AzaC на четвертый день и общее количество отложенных яичных мешочков / состояние, зарегистрированное на восьмой день.Двусторонний тест Стьюдента t использовался для определения статистических различий в яйцевых мешочках, отложенных между обработками.

Ферментативные анализы BgDNMT и BgMBD2 / 3

Ядерные белки экстрагировали из головы / стопы голодающих NMRI и пигментированных гибридных взрослых улиток (20 мг ткани, полученной от 4 особей / штамм) с использованием набора Epiquik Nuclear Extraction Kit (Epigentek). Активность ДНК-метилтрансферазы, содержащейся в 7 мкг экстрактов ядерных белков, впоследствии измеряли с использованием набора для анализа активности / ингибирования ДНК-метилтрансферазы EpiQuik (Epigentek).Флуоресцентные показания (530 _EX /590 _EM нм) были получены с использованием устройства для считывания микротитровальных планшетов POLARstar Omega (BMG Labtech), и данные были нормализованы, как описано ранее [27]. Активность MBD улитки измеряли в 10 мкг экстрактов ядерных белков с использованием набора EpiQuik MBD2 Binding Activity / Inhibition Assay Kit (Epigentek). Показания флуоресценции получали, как указано выше, и данные затем нормализовали как для отрицательного контроля (10 мкг BSA), так и для положительного контроля (MBD2, поставляемый набором).Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), и каждый анализ повторяли не менее двух раз.

Обнаружение 5mC на основе ELISA

гДНК выделяли из пула четырех голодных индивидуальных NMRI или пигментированных гибридных улиток с использованием набора DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). Затем последовала стадия обработки РНКазой (Invitrogen), и содержание 5mC было затем определено флуорометрическим методом из 100 нг без РНК гДНК с использованием набора для количественного определения метилированной ДНК SuperSense (Epigentek), как описано ранее [27].Анализ был выполнен в двух экземплярах, повторен дважды, и показания представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Содержание 5mC было рассчитано на основе B . Содержание GC в геноме glabrata (35%) с использованием следующего уравнения:

BS-PCR: Локус-специфическое обнаружение 5mC

Превращение бисульфита проводили, как описано ранее Fneich et al . [26]. Вкратце, 300 нг гДНК (полученная из пула из 10 отдельных улиток штамма BgBRE) денатурировали 3М NaOH и затем обрабатывали раствором бисульфита натрия и гидрохинона при pH 5 в темноте в течение 4 часов при 55 ° C.После этого гДНК обессоливали (колонка Amicon Ultra, UFC510024 Millipore), десульфировали добавлением 350 мкл 0,1 М NaOH и, наконец, растворяли в 50 мкл 10 мМ Трис / Cl (pH 8). Затем была проведена вложенная ПЦР для амплификации областей гена Bg14-3-3 (Scaffold 8484: 17058–17923). Пары праймеров были сконструированы с использованием MethPrimer [53] на геномных последовательностях, извлеченных из предварительной сборки генома v4.3 [54], как указано в таблице S1. Первоначальную ПЦР-амплификацию проводили с использованием 1 мкл образцов гДНК, преобразованных бисульфитом, в качестве матриц с внешним праймером, установленным следующим образом: 94 ° C в течение 2 минут, 5 циклов 94 ° C в течение 1 минуты, 46 ° C в течение 2 минут и 72 ° C. C в течение 3 минут, затем 25 циклов 94 ° C в течение 30 секунд, 46 ° C в течение 2 минут, 72 ° C в течение 1:30 минут и, наконец, 72 ° C в течение 10 минут.Вложенную ПЦР выполняли при 10-кратном разведении первого продукта ПЦР с использованием внутреннего праймера, установленного в тех же условиях, что и для первой ПЦР, за исключением температуры отжига, которая была увеличена до 50 ° C. Последующую реакцию ПЦР проводили в 25 мкл с использованием 1,25 единиц ДНК-полимеразы Go Taq (Promega), dNTP в концентрации 0,4 мкМ для каждого дезоксинуклеотида и праймеров в концентрации 0,4 мкМ. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом через 1% агарозный гель для проверки специфической амплификации каждого гена-мишени.Для анализа с высоким разрешением 1 мкл каждого продукта ПЦР клонировали в pCR4 (набор для клонирования TOPO TA, Invitrogen), а положительные клоны секвенировали с вектор-специфическими праймерами (таблица S1) с использованием средств секвенирования GenoScreen (Campus de l’Institut Pasteur de Lille , Франция). Последовательности, полученные из гДНК, обработанной бисульфитом, были выровнены с их соответствующей геномной эталонной последовательностью в Bioedit v7.2.5 [55] для идентификации метилированных цитозинов. Программное обеспечение MethTools v2.0 [56] использовалось для создания графического представления каждой целевой области, содержащей метилированные сайты.Набор данных Whole Genome Bisulfite-Seq (WGBS), выполненный как часть B . Проект генома glabrata (публикация генома, находится на рассмотрении) был затем проверен на наличие метилированных сайтов CpG в гене Bg14-3-3 с использованием браузера генома IGV v2.3 [57].

qRT-PCR контроля против клеток Bge, обработанных LTP

Чтобы проверить влияние продуктов, продуцируемых естественным путем, личинок на экспрессию эпигеномного аппарата в клетках улиток, B .Эмбриональная клеточная линия glabrata (Bge) подвергалась воздействию in vitro на S . mansoni продуктов трансформации личинок (LTP; [58]) в течение 24 часов при 26 ° C и подверглись анализу qRT-PCR. Вкратце, мРНК выделяли из контрольных и обработанных LTP клеток Bge, а также клеток Bge, обработанных S . mansoni продукты трансформации личинок (LTP), как описано ранее [59]. qRT-PCR впоследствии использовали для исследования обилия транскриптов Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3 между образцами, полученными из обработанных LTP, по сравнению с контрольными клетками.Амплификации выполняли на приборе для qRT-PCR StepOnePlus (ABI) с использованием химии SYBR Green (ABI); Последовательности праймеров можно найти в таблице S1 (BgMBD2 / 3 qRT-PCR1). Значения Ct целевых генов были нормализованы до уровня транскрипта эталонного гена Actin (GenBank: Z72387; [58]) с использованием метода Pfaffl, как описано в Chalmers et al . [52]. Результаты основаны на двух биологических повторностях, и каждую реакцию qRT-PCR проводили в технических дубликатах. Не наблюдали амплификации в реакциях отрицательного контроля (H ₂ O вместо матрицы кДНК).

Результаты и обсуждение

Подтверждение последовательности и характеристика BgMBD2 / 3

Поиск tBLASTn по предварительному запросу B . Сборка генома glabrata v4.3 [54] с использованием известных гомологов MBD моллюсков ( A . californica —GenBank: XP_005103642.1, C . гига MBD2 / 3 — GenBank: EKC328ank: EKC328). выявили присутствие единственного белка MBD. Последующий поиск BLASTp в базе данных NCBI с использованием предсказанной последовательности продемонстрировал 75% идентичность с A . californica гомолог (NP_00510364.2; E-значение 2e ^-156 ). Это подтверждает выводы Fneich et al . [26], которые ранее идентифицировали частичный гомолог MBD2 / 3 в предварительном B . Сборка генома glabrata , а также в доступных наборах данных RNA-Seq. Последовательность транскрипта, кодирующая предсказанную ORF из 242 аминокислотных остатков B . glabrata Гомолог MBD2 / 3 (BgMBD2 / 3) впоследствии был амплифицирован из кДНК головы / стопы взрослого NMRI, и анализ поиска домена PFAM клонированного продукта (GenBank: KJ951055) выявил присутствие N-концевого домена MBD (PF01429), а также С-концевой домен, консервативный среди белков семейства MBD2 и MBD3 (PF14048). Множественное выравнивание последовательностей BgMBD2 / 3 с родственными белками дополнительно продемонстрировало высокий уровень консервативности последовательности по всему N-концевому домену MBD и высокое сходство со специфическими для беспозвоночных белками MBD2 / 3, а также с гомологами MBD2 и MBD3 мыши (рис. 1). .

Рис. 1. B . glabrata содержит метил-CpG-связывающий белок, BgMBD2 / 3, который имеет высокое сходство последовательностей с эукариотическими белками MBD.

Выравнивание областей метил-CpG-связывающего домена (PF01429) и C-концевого домена белка 2 и 3 метил-CpG-связывающего домена (PF14048) с использованием MUSCLE [31].Сокращения Bg, Ac, Lg, Cg, Hr, Ct, Sm, Em, Smed, Bm, Hp и Mm относятся к B . глабрата , А . Калифорния , L . гигантеа , С . гига , H . робуста , С . телета , S . mansoni , E . multilocularis , S . mediterranea , B . mori , H . pulcherrimus и M . musculus . Звездочка в верхней строке указывает функционально важные аминокислоты в области домена связывания метила. Цифры в начале каждой строки представляют положения аминокислот, и в каждом положении наиболее консервативные остатки дополнительно заштрихованы черным цветом, полуконсервативные остатки выделены серым цветом, а неконсервативные аминокислоты остаются белыми. «Консенсус» представляет собой консенсусную последовательность Pfam каждого домена, где консервативные аминокислоты (50–79%) обозначены строчными буквами, а высококонсервативные остатки (> 80%) — заглавными буквами.Отсутствующие аминокислотные остатки, отсутствующие в усеченных кандидатах CtMBD2 / 3, обозначены «N / A».

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g001

Кроме того, в отличие от MBD3 млекопитающих, который обладает ограниченной способностью связывания 5mC из-за одной замены аминокислоты [60], наличие критических остатков (указано в выравнивании звездочкой: R14, K22, Y26, R36), необходимого для связывания белка с метилированной ДНК [32], позволяет нам предположить, что гомолог улитки будет функциональным членом этого семейства белков. Присутствие C-концевой области, уникальной для белков MBD2 и MBD3 (PF14048), в дополнение к отсутствию гликозилазного домена (характерного для MBD4) и мотива Zn-finger (обнаруженного в MBD1) предполагает, что B . glabrata MBD является новым гомологом MBD2 / 3. Филогенетический анализ, основанный на байесовских выводах и выводах максимального правдоподобия для BgMBD2 / 3 с охарактеризованными MBD, предоставляет дополнительные подтверждающие доказательства того, что B . glabrata MBD является de facto гомологом MBD2 / 3 (рис. 2).

Рис. 2. BgMBD2 / 3 представляет собой гомолог клады MBD2 / 3, специфичной для беспозвоночных.

Филогенетическая реконструкция, основанная на методах Байеса (Mr Bayes v3.1.2) и метода максимального правдоподобия (MEGA v5.2.2), оценивалась на основе множественного выравнивания последовательностей на основе домена MBD 28 последовательностей MBD эукариот. Обозначения Cs, Ov, Pw, Sm, Sj, Fh, Em, Eg, Ts, Hm, Smed, Hr, Lg, Ac, Cg, Ct, Hp, Mm, Xl и Xt относятся к C . sinensis , O . viverrini , P . Вестермани , S . mansoni , S . japonicum , F . гепатика , С . sinensis , E . multilocularis , E . granulosus , Т . солий , H . микростом , S . mediterranea , M . Линьяно , H . робуста , л . гигантеа , А . Калифорния , С . гига , C . телата , H . pulcherrimus , M . musculus , X . laevis и X . tropicalis . Графический вывод филограммы байесовского консенсуса был получен с помощью Figtree v1.3.1 [36], а BgMBD2 / 3 заключен в красную рамку. Метки узлов в круглых скобках представляют собой процентные значения поддержки начальной загрузки из анализа максимального правдоподобия (500 повторений начальной загрузки, выполненных с использованием модели JTT), в то время как те, которые находятся за пределами скобок, представляют значения поддержки байесовской апостериорной вероятности (на основе выполнения четырех независимых прогонов Монте-Карло цепи Маркова для 1000000 поколений с использованием Модель WAG). Показаны только узлы со значениями поддержки байесовской апостериорной вероятности> 0,5.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g002

Как и ожидалось для организма беспозвоночных, BgMBD2 / 3 объединяется со специфическими для беспозвоночных белками MBD2 / 3, а также близкородственными членами MBD2 и MBD3 позвоночных. Тем не менее, модель B . glabrata гомолог MBD2 / 3 помещен с большой надежностью (значение начальной загрузки 99, апостериорная вероятность 1,00) вне отдельной клады гомологов MeCP2, MBD1 и MBD4 позвоночных и является наиболее сходным (значение начальной загрузки 89, апостериорная вероятность 1.00) к другому образцу моллюска MBD2 / 3 ( A . californica AcMBD2 / 3).

Подтверждение последовательности и биоинформатическая характеристика BgDNMT2 и BgDNMT1

После идентификации гомолога MBD в пределах B . glabrata геном (BgMBD2 / 3), последующий tBLASTn против сборки генома с использованием гомологов эукариотических Dnmt ( M . musculus DNMT1 — GenBank: P13864.5, A . GenBank: NPB.1, С . кишечник DNMT1 — XP_002122948.1) выявил присутствие Dnmt1, а также кандидата Dnmt2 в B . glabrata (рис.3).

Рис. 3. Модель B . glabrata Геном кодирует членов семейства ДНК-метилтрансферазы 1 (BgDNMT1) и 2 (BgDNMT2).

A) Мультяшное изображение BgDNMT1 и BgDNMT2. C-концевых каталитических домена ДНК-метилазы (PF00145), присутствующих в BgDNMT1 и BgDNMT2, выделены красным.Римские цифры (I, IV, VI, VIII, IX и X) в домене DNMT обозначают высококонсервативные мотивы, а TRD представляет домен распознавания-мишени. В BgDNMT1 этот домен ДНК-метилазы связан с N-концевой регуляторной областью через линкер KG (черная вертикальная полоса; положение аминокислот 833–843). Регуляторный домен содержит сигнал ядерной локализации (NLS), обозначенный звездочкой, домен фокусов репликации цитозин-специфической ДНК-метилтрансферазы (RFD; PF12047), домен Zinc Finger CXXC (PF02008) и два домена гомологии, прилегающих к брому (BAH). (PF01426), окрашенные в зеленый, серый и бирюзовый цвета соответственно.Цифры представляют положения аминокислот. В) В . glabrata Гомологи DNMT имеют большое сходство последовательностей во всем каталитическом домене ДНК-метилазы (PF00145). Множественное выравнивание последовательностей инвариантных С-концов (как предсказано поиском домена Pfam) BgDNMT1 и BgDNMT2 с гомологичными ферментами выполняли с использованием MUSCLE (сравнение множественных последовательностей методом логарифмического ожидания; [36]). Шесть высококонсервативных мотивов каталитического домена обозначены римскими цифрами (I, IV, VI, VIII, IX и X), а TRD обозначает домен распознавания цели.Функционально важные остатки выделены звездочкой, а числа в начале каждого мотива представляют положения аминокислот. Наиболее консервативные остатки дополнительно заштрихованы черным цветом, полуконсервативные остатки выделены серым цветом, а неконсервативные аминокислоты — белым. «Консенсус» представляет собой консенсусную последовательность Pfam каждого домена, где консервативные аминокислоты (50–79%) обозначены строчными буквами, а высококонсервативные остатки (> 80%) — заглавными буквами.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pntd.0005246.g003

После этого выполняется поиск BLASTp в базе данных NCBI с предсказанным B . Последовательности ДНК-метилтрансферазы glabrata выявили 54% идентичности BgDNMT2 с L . Гомолог gigantea (XP_00

47.1; 2e ^-134 ) и 75% идентичности BgDNMT1 с A . californica последовательность DNMT1 (XP_00509576.1; E-значение 0,0). Используя предварительную сборку генома и доступные наборы данных RNA-Seq, Fneich et al ранее идентифицировали частичные последовательности DNMT1 и DNMT2.(2013). Подобно BgMBD2 / 3, последовательности двух предсказанных ДНК-метилтрансфераз были подтверждены с использованием кДНК, полученной из головы / стопы взрослых улиток NMRI. Нам удалось подтвердить полную ORF из 393 аминокислотных остатков BgDNMT2 (GenBank: KJ951056), а также 550 аминокислотных C-концевых областей BgDNMT1, которые включают каталитический домен. Последующий поиск домена Pfam выявил присутствие домена метилазы ДНК (PF00145), содержащего шесть высококонсервативных мотивов (I, IV, VI, VIII, IX и X), и целевой домен узнавания (TRD) в обоих BgDNMT2 (аминокислотные остатки 3– 415) и BgDNMT1 (аминокислотные остатки 863–1,314) членов (Рис. 3A).Напротив, регуляторный домен, содержащий сигнал ядерной локализации (NLS), домен фокусов репликации цитозин-специфической ДНК-метилтрансферазы (RFD; PF12047), домен Zinc Finger CXXC (PF02008) и два домена гомологии, прилегающих к брому (BAH) (PF01426) ) были обнаружены только в BgDNMT1 (рис. 3А).

Последующее выравнивание C-концевых доменов ДНК-метилазы BgDNMT1 и BgDNMT2 (PF00145) с известными ферментами DNMT выявило сильное сходство последовательностей шести наиболее консервативных мотивов (I, IV, VI, VIII, IX и X) (рис. 3B).В частности, каталитически важный дипептид пролин / цистеин [61] присутствует как в BgDNMT2 (P77 и C78), так и в BgDNMT1 (P949 и C950). Чтобы различать два семейства ферментов, были отмечены замены DNMT2-специфических остатков в BgDNMT2: тирозин (Y) на фенилаланин (FXGXG) в мотиве I и аспарагин (N) на глутамин (QXGXG) в мотиве VIII [61]. Более того, DNMT2-специфический трипептид цистеин / фенилаланин / треонин (CFT) в целевом домене распознавания (TRD) уникально присутствует в BgDNMT2, но не в BgDNMT1.Филограмма, основанная на выравнивании последовательностей 29 репрезентативных эукариотических членов всех трех семейств ДНК-мтаз (DNMT1, DNMT2 и DNMT3), четко разделяет BgDNMT2 и BgDNMT1 на их отдельные клады (рис. 4).

Рис. 4. B . glabrata Гомологи DNMT являются новыми членами семейства ферментов DNMT.

Филогенетические отношения, основанные на подходах Байеса (Mr Bayes v3.1.2) и максимального правдоподобия (MEGA v5.2.2), были выведены из множественного выравнивания последовательностей шести высококонсервативных мотивов в каталитическом домене (PF00145) из 29 таксонов с использованием MUSCLE [31].BgDNMT1 и BgDNMT2 обозначены красными полями. Сокращения Bg, Ac, Lg, Ct, Hr, Ci, Mm, Smd, Em, Sm, Fh, Am и Cq относятся к B . глабрата , А . Калифорния , L . гигантеа , С . гига , C . телета , H . робуста , С . кишечник , M . musculus , S . mediterranea , E . multilocularis , S . mansoni , F . гепатика , А . mellifera и C . quinquefasciatus . Дерево консенсуса байесовского анализа проиллюстрировано (Figtree v1.3.1, [36]) с длинами ветвей, обозначающими расстояние между таксонами. Метки узлов в круглых скобках представляют собой процентные значения поддержки начальной загрузки из анализа максимального правдоподобия (500 повторений начальной загрузки, выполненных с использованием модели JTT), в то время как те, которые находятся за пределами скобок, представляют значения поддержки байесовской апостериорной вероятности (на основе выполнения четырех независимых прогонов Монте-Карло цепи Маркова для 1000000 поколений с использованием Модель WAG).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g004

Несмотря на то, что ДНК-метилтрансфераза является наиболее консервативной из всех ДНК-метилтрансфераз, биологическая функция ферментов DNMT2 является весьма спорной, и ее способность метилировать ДНК-мишень подвергается сомнению. неоднократно [62,63]. Тем не менее, его двойная биологическая активность и субстратная специфичность в настоящее время становятся все более общепринятыми. Например, у млекопитающих DNMT2 преимущественно служит тРНК-метилтрансферазой [64].Однако у низших эукариот DNMT2 обычно функционирует как единственная ДНК-метилтрансфераза [27,65,66]. Тем не менее, как и другие моллюски (то есть тихоокеанские устрицы [67]), B . glabrata Геном кодирует, помимо белка DNMT2, гомолог DNMT1. Последнюю обычно называют поддерживающей ДНК-метилтрансферазой, поскольку члены этого семейства ферментов предпочтительно метилируют гемиметилированную ДНК [68]. В отличие от гомологов DNMT2, ферменты DNMT1 дополнительно имеют большой регуляторный N-концевой домен, состоящий из нескольких примечательных элементов (рис. 3A).Поскольку BgDNMT1 содержит эти домены в консервативном порядке: 1) домен очага репликации DNMT1 (RFD; PF12047), домен цинкового пальца (CXXC; PF02008) и два соседних домена гомологии брома (BAH; PF01426), 2) имеет предсказанный Сигнал ядерной локализации (NLS) между остатками 40–48 (QGSAKRIKLQ) и 3) включает линкер повтора KG ((KG) ₄ ; [69]), соединяющий каталитический домен и N-концевые области (между остатками 833–843). ), мы предлагаем это B . Гомолог glabrata является функциональным членом этого семейства ДНК-метилтрансфераз.Несмотря на тщательные поиски, гомолог DNMT3A или B не был обнаружен в геноме S . mansoni ’ является промежуточным хозяином улитки, что позволяет предположить, что BgDNMT1 (и в меньшей степени BgDNMT2) функционирует как основная цитозинметилтрансфераза у этого вида беспозвоночных.

Наша идентификация ДНК-метилтрансферазы DNMT1 и DNMT2 (но не DNMT3) в B . Геном glabrata соответствует результатам, недавно полученным для A . californica , но отличается от обнаружения полного набора DNMT (DNMT1, DNMT2 и DNMT3) в C . гига и л . гигантея [70]. Такое дифференциальное включение / исключение DNMT в геномах моллюсков также наблюдалось в филюме Arthropoda, где некоторые члены содержат все три семейства ДНК-метилтрансфераз (например, Apis mellifera [71] и Nasoni spp . [72]), другие (например, Locusta migratoria [73]), B . mori [71]), Tribolium castaneum [74] и Schistocerca gregaria [75] содержат только гомологи DNMT2 и DNMT1, в то время как другие ( Drosophila melanogaster [76]) содержат только один фермент DNMT2, отвечающий за все Модификации 5mC. Как и в случае с членистоногими, значение исключения DNMT3 у определенных видов моллюсков (например, B . glabrata ) требует дальнейших исследований.

Тканеспецифическая экспрессия

B . glabrata Оборудование для метилирования ДНК

Используя преимущества наборов данных RNA-Seq, созданных как часть B . Проект генома glabrata (публикация генома, находится на рассмотрении), мы смогли изучить обилие транскриптов механизма метилирования ДНК улитки в диапазоне двенадцати различных тканей (белковая железа, образование в щечной области, центральная нервная система, пищеварительная железа / гепатопанкреас, голова / стопа, сердце / APO, почка, край мантии, яйцеклетки, слюнные железы, желудок и терминальные гениталии).В целях изучения экспрессии механизма метилирования ДНК между гонадными тканями и соматическими тканями образцы с 1 по 10 (белковая железа, щечная масса, центральная нервная система, пищеварительная железа / гепатопанкреас, голова / стопа, сердце / APO, почка, край мантии, слюнная жидкость). железы и желудок) рассматривали как одну популяцию (Группа 1), образец 11 (яйцеклетки) рассматривали как вторую популяцию (Группа 2), а образец 12 (конечные гениталии) считали третьей популяцией (Группа 3) (рис. 5). .

Рис. 5. Модель B . glabrata Аппарат метилирования ДНК обильно экспрессируется в половых тканях и гемоцитах.

A) Анализ RNA-Seq B . glabrata Аппарат метилирования ДНК в двенадцати тканях улитки. Нормализованные значения секвенирования [51] для каждого интересующего гена (т.е. Bgmbd2 / 3 , Bgdnmt1 и Bgdnmt2 ) по двенадцати тканям были использованы для оценки параметров выборки для этого гена, то есть среднего и стандартного отклонения.Двенадцать наблюдений для каждого гена были масштабированы до стандартизированного t-распределения. Эти стандартизованные подсчеты для трех генов были нанесены (ось y) против двенадцати тканей (ось x) — непрерывная красная линия на оси y при 1,79 представляет p <0,05 на t-распределении с 11 градусами. свободы. Образцы были разделены на три группы: группа 2: яйцеклетки (OVO), группа 3: терминальные гениталии (TRG) и группа 1: слюнные железы (SAL), пищеварительная железа / гепатопанкреас (DG / HP), центральная нервная система (ЦНС). ), щечная масса (BUC), альбуминовая железа ( AG), край мантии (MAN), голова / стопа (FOOT), желудок (STO), сердце / APO (HAPO) и почка (KID).Анализ дифференциальной экспрессии с использованием DESeq2 [51] показывает сравнение групп 1 с группой 2 и группы 1 с группой 3 для Bgmbd2 / 3 , Bgdnmt1 и Bgdnmt2 обилия (т.е. образцы тканей с данными выше красная линия) статистически значимы для интересующего гена. B) Данные qRT-PCR подтверждают тканевую экспрессию B . glabrata Аппарат метилирования ДНК. qRT-PCR использовали для проверки обилия транскриптов Bgdnmt1 , Bgdnmt2 и Bgmbd2 / 3 в пяти тканях, ранее проанализированных с помощью RNAseq.В дополнение к альбуминовой железе ( AG), голове / стопе (FOOT), желудку (STO), яйцеводам (OVO) и пищеварительной железе / гепатопанкреасу (DG / HP) также определяли обилие транскриптов в гемоцитах (HAEMO). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего (SD). Значения Ct генов-мишеней были нормализованы к референсному гену S19 [77]. Биологические дубликаты использовались для каждой ткани, а технические трижды выполнялись для каждой реакции qRT-PCR. Для гемоцитов был доступен только один биологический образец. C) Обработка 5-AzaC ингибирует B . glabrata яйцекладка. Взрослых улиток NMRI (10–12 особей / состояние) инкубировали в присутствии или в отсутствие 491 мкМ 5-AzaC в течение восьми дней. Гистограмма представляет среднее количество отложенных яиц / состояние на восьмой день + стандартное отклонение (SD). Двусторонний тест Стьюдента t был проведен для выявления значительных различий между видами лечения. Изображения представляют собой мешочки для яиц, полученные в контрольных условиях и в условиях 5-AzaC, и были сделаны через 7 дней после осаждения. D) Представление тепловой карты генов в районе Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3 , которые значительно избыточно или недостаточно экспрессируются в OVO (ovotestes). Гены сгруппированы в двух направлениях, то есть по выборкам и по генам. Uniprot присвоила этим генам короткие названия на основе гомологии последовательностей (полное название включено в таблицу S2).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g005

Дифференциальный анализ транскрипции Bgmbd2 / 3 , Bgdnmt1 и Bgdnmt2 среди тканей улитки (группа 2 vs.Группа 1 или Группа 3 по сравнению с Группой 1) выявили статистически значимое ( p <0,05) повышенную экспрессию Bgmbd2 / 3 как в яйцеклетках, так и в терминальных гениталиях, Bgdnmt1 в яйцеклетках и Bgdnmt2 в терминальных гениталиях (рис. 5A). и S1 рис). Эти результаты впоследствии были подтверждены с помощью qRT-PCR (рис. 5B). Тканевая экспрессия генов Bgdnmt1 , Bgdnmt2 и Bgmbd2 / 3 в структурах гонад (по сравнению с соматическими) согласуется с наблюдениями Riviere et al .которые продемонстрировали повышенное количество транскриптов ортологов DNMT1, DNMT2 и MBD в C . гига ооцитов (по сравнению с другими тканями) [67]. Эти данные в совокупности предполагают видную роль этих основных компонентов эпигенетических механизмов в тканях гонад моллюсков и клетках, происходящих из них или заселяющих их. Значительное ингибирование B . glabrata производство яиц / развитие эмбриона, опосредованное деметилирующим агентом ДНК 5-азацитидином (5-AzaC) (рис. 5C), дополнительно подтвердило эти результаты транскрипции и подтвердило физиологическую роль метилирования ДНК в репродуктивных процессах улиток.

В дополнение к этим 12 различным тканям, содержание мРНК Bgdnmt1 , Bgdnmt2 и Bgmbd2 / 3 также измеряли с помощью qRT-PCR в гемоцитах, полученных из гемолимфы (рис. 5B). Как циркулирующие защитные клетки гемоциты являются частью врожденной иммунной системы улитки и, следовательно, участвуют в иммунном ответе хозяина на инфекцию паразитов [78]. Несколько исследований ранее продемонстрировали, что гены стрессовой реакции улиток (например, белки теплового шока) значительно модулируются после заражения трематодами [79,80].Метилирование ДНК обычно связано с регуляцией транскрипции во время стрессовых реакций у эукариот [81,82], и действительно, Ittiprasert et al. [83] недавно показали, что эта эпигенетическая модификация играет важную роль во время шистосомных инфекций через модуляцию белков теплового шока. Следовательно, повышенная экспрессия ядра B . glabrata Аппарат метилирования ДНК в гемоцитах предполагает эпигенетическую связь с транскрипцией hsp70 и, возможно, с механизмами защиты хозяина.

Так как наши данные подтверждают наличие функционала B . glabrata механизм метилирования, мы ожидали идентифицировать дополнительные эпигенетически связанные гены, которые будут ко-экспрессироваться с Bgdnmt1 , Bgdnmt2 и Bgmbd2 / 3 в двенадцати проанализированных тканях. Поэтому с использованием DESeq2 [51] был проведен анализ попарной дифференциальной экспрессии между Группой 2 (яйцеклетки) и Группой 1 (соматические ткани) и Группой 3 (концевые гениталии) и Группой.Образцы группы 1 для идентификации совместно регулируемых генов Bgdnmt1 , Bgdnmt2 и Bgmbd2 / 3 . Используя отсечение FDR, равное 10% [46], и абсолютное log2-кратное изменение по крайней мере на 1 в любом из двух сравнений, более 1000 генов были значительно больше, а 180 генов были значительно меньше представлены в овотестах, тогда как 850 генов были значительно меньше. были значительно больше, и 440 генов были значительно меньше представлены в терминальных гениталиях. И Bgdnmt1 , и Bgmbd2 / 3 прошли эти строгие критерии FDR и логарифмического изменения кратности (подтверждая анализ t-распределения на рис. 5A) у овотестов (группа 2 vs.Группа 1), но не в терминальных гениталиях. Напротив, при применении одинаковых строгих пороговых значений FDR и логарифмических изменений кратности, Bgdnmt2 не проявлял значительной дифференциальной экспрессии в любой ткани.

Анализ генной сети был проведен для дальнейшей классификации дифференциально экспрессируемых генов, которые имеют общие биологические функции и сходные количества связанных с тканями транскриптов, с Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3 . Поскольку транскрипты только двух компонентов механизма метилирования ДНК ( Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3 ) были значительно повышены в гонадных (OVO) по сравнению ссоматических тканей последующий анализ отношений между генами и сетями был сосредоточен только на этих двух генах. Были присвоены GO-члены 1180 идентифицированных транскриптов овотестов, и отношения между этими генными продуктами были затем изображены в виде сети положительно (R ≥ 0,6) или отрицательно (R ≤ -0,6) коррелированных генов, разделяющих «биологический процесс» GO. термины. Используя аналогию «вины по ассоциации», предложенную Мерико и его коллегами [49], соседство Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3 показало сильно взаимосвязанный кластер из 53 генов (фиг. S2 и таблица S2) и экспрессию этих генов. гены во всех 12 тканях показаны на тепловой карте на рис. 5C.Неудивительно, что в список включены гены, которые ранее были связаны с эпигенетическими механизмами или ремоделированием хроматина и известны своим взаимодействием с гомологами DNMT1. Например, RBL1, белок, участвующий в репрессии транскрипции посредством образования гетерохроматина путем стабилизации метилирования гистонов, также имеет признанную функцию в регуляции транскрипта DNMT1 [84]. В дополнение к RBL1, сеть, проиллюстрированная на фиг. S2, также указывает на сильную связь Bgdnmt1 с гистоновыми метилтрансферазами (HMT), а именно SUV39h3, SETD8 и SETDB1.Эти данные согласуются с исследованиями HMTs млекопитающих, которые, как известно, связываются с ДНК-метилтрансферазами или модулируют их [85,86].

Модель

B . glabrata Аппарат метилирования ДНК по-разному активен у инбредных штаммов улиток по сравнению с аутбредными гибридами

В то время как о функциональном аппарате метилирования ДНК ранее сообщалось в B . glabrata , прямое сравнение активности ДНК-метилтрансферазы и MBD между различными популяциями улиток (например,грамм. инбредные против беспородных особей) отсутствуют. Это побудило нас измерить как ДНК-метилтрансферазу [87], так и активность связывания MBD [88] в экстрактах ядерных белков, полученных из головы / стопы взрослых популяций NMRI инбредных и пигментированных беспородных улиток, а также количественно определить уровни m5C в их пулах гДНК (рис. 6).

Рис. 6. Беспородный (пигментированный) B . glabrata улитки содержат более высокую активность ДНК-метилтрансферазы, MBD-связывающую способность и геном 5mC по сравнению с инбредными (NMRI) улитками.

ДНК-метилтрансфераза и активность связывания MBD измеряли флуорометрически в ядерном белке, выделенном из ткани головы / стопы взрослых улиток. A) Активность DNMT измеряли в 7 μ г B . glabrata (NMRI и пигментированные гибридные штаммы), экстракт ядерного белка (n = 2) с использованием набора для анализа активности / ингибирования ДНК-метилтрансферазы EpiQuik (Epigentek). единиц относительной флуоресценции (RFU) получали при 530 _EX /590 _EM нм и затем нормализовали к холостому отрицательному контролю (только буфер для анализа) и положительному контролю (Dnmt1).Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD) нормированных средних значений. B) MBD-связывающая активность в пределах 10 μ г B . Экстракт ядерного белка glabrata (NMRI и пигментированные гибридные штаммы) (n = 2) измеряли с помощью набора для анализа активности / ингибирования связывания EpiQuik MBD2 (Epigentek). 10 мкг БСА использовали в качестве отрицательного контроля. Флуоресценцию считывали при 530 _EX /590 _EM нм, а затем значения нормализовали к холостому отрицательному контролю (только буфер для анализа).Планки погрешностей представляют собой ± стандартное отклонение (SD) нормированных средних значений. C) 5mC обнаружен в B . glabrata гДНК (100 нг), полученная как из альбиносных NMRI, так и из пигментированных гибридных штаммов (n = 2) с использованием набора для количественного определения метилированной ДНК MethylFlash (Epigentek). Уровень 5mC измеряли в единицах относительной флуоресценции (RFU) при 530 _EX /590 _EM нм и нормализовали к отрицательному (синтетическая неметилированная ДНК с 50% содержанием цитозина) и положительному контролю (синтетическая метилированная ДНК с 50% Содержание 5 мкКл).* указывает на значительную разницу (двусторонний t-критерий Стьюдента; p <0 . 05 ) между уровнем 5mC NMRI и пигментированными улитками. Показания показаны как средние, а столбики ошибок представляют ± стандартное отклонение (SD). Содержание 5 мкС (%), отображаемое над столбцами, было рассчитано на основе B . Содержание GC в геноме glabrata (35%), как описано в разделе «Материалы и методы».

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g006

Во-первых, с помощью анализа на основе ELISA, измеримые количества активности DNMT присутствовали в ядерных экстрактах обоих штаммов (рис. 6A).Эти данные подтверждают наше описание предполагаемых функциональных членов семейств BgDNMT1 и BgDNMT2 (Рис. 3) и подтверждают наблюдения других [26,27,83]. Интересно, что эти уровни активности DNMT были повышены в пигментированном гибридном штамме по сравнению с инбредным штаммом NMRI. Во-вторых, мы оценили активность связывания MBD (снова с использованием анализа на основе ELISA) в тех же образцах, которые показали, что экстракты ядерных белков обоих штаммов улиток дополнительно содержат белки MBD, способные связываться с метилированной ДНК (что подтверждает биоинформатическую идентификацию предполагаемой функциональной BgMBD2 / 3, рис. 1).Подобно анализу DNMT, активность MBD выше в образцах пигментированных гибридных улиток (рис. 6B). Наконец, общие уровни 5mC были количественно определены флуорометрическим методом в образцах гДНК, полученных как из NMRI, так и из пигментированного B . glabrata популяций (рис. 6С). Основываясь на содержании геномного CG 35% (публикация генома, находится на рассмотрении), количество общего метилирования цитозина было оценено в 1,34% и 4,28% для NMRI и пигментированного гибридного штамма соответственно. Эти значения находятся в пределах диапазона уровней метилирования ДНК, обнаруженного у других беспозвоночных [89], подобны процентному содержанию 5mC, обнаруженному у других моллюсков [90], и близки к 2%, ранее сообщенным Fneich et al .[26] в штамме BgBRE с использованием подхода, основанного на ЖХ-МС. Интересно, что значительно более высокие уровни ( p <0,05) детектируемого 5mC в пулах гДНК пигментированного гибрида по сравнению со штаммом NMRI находятся в соответствии с анализами активности MBD и DNMT (рис. 6A и 6B).

Принято считать, что гибриды растений и животных часто проявляют разные признаки и повышенную приспособленность по сравнению с инбредными популяциями (например, повышенная плодовитость [91,92]). Это повышение производительности обычно называют энергией гибрида или гетерозисом, и до сих пор эпигенетические механизмы, лежащие в основе этого явления, полностью не охарактеризованы [93,94].Однако недавно роль эпигенетики была задействована в нескольких исследованиях, демонстрирующих важность динамики метилома ДНК, направляемой малой РНК, в повышении производительности гибридов (например, Groszmann et al . [95]). Кроме того, более подходящими к нашим текущим открытиям были сообщения Шена и его коллег, которые обнаружили, что повышенные уровни 5mC у гибридных особей приводят к глобальным изменениям транскрипции и способствуют гетерозису у Arabidopsis thaliana [96].Хотя наши наблюдения могут просто отражать различия в жизненных чертах, более тщательный анализ метилирования ДНК в B . glabrata популяции, которые демонстрируют различную восприимчивость к шистосомной инфекции, поддерживают различное географическое распределение или подвергаются различным лабораторным давлениям, могут пролить дополнительный свет на предполагаемую роль этого эпигенетического процесса в гетерозисе моллюсков.

Анализ BS-PCR высокого разрешения показывает присутствие 5mC в экзонах

B . glabrata 14-3-3 ген

В то время как Fneich et al . [26] ранее продемонстрировали, что не-LTR повторяющийся элемент Nimbus ( BgI ) либо сильно метилирован, либо неметилирован, те же авторы предположили, что B . glabrata Геном состоит из плотно метилированных областей, чередующихся с участками неметилированной ДНК, из-за бимодального распределения наблюдаемого соотношения CpG к ожидаемому (CpGo / e) в генах, кодирующих белок.Этот так называемый мозаичный паттерн метилирования ДНК был дополнительно подтвержден экспериментом Whole Genome Bisulfite-Seq (WGBS) как часть B . Проект генома glabrata (публикация генома, на рассмотрении). Это наблюдение согласуется с многочисленными исследованиями беспозвоночных [73, 97–99] и описывает существование двух типов метилированных генов: сильно метилированных (кодирующих домашние белки) и низкометилированных (кодирующих индуцибельный ген продукты).Таким образом, чтобы поддержать WGBS-анализ генома улитки и подтвердить предсказания in silico CpG o / e Фнейха и др. . [26], а также чтобы максимизировать наши шансы на идентификацию устойчивых сигналов 5mC в пределах B . glabrata, ген, кодирующий белок (аналогично тому, который недавно был обнаружен для Bg-hsp70 [83], мы проанализировали статус метилирования области 451 п.н. гена домашнего хозяйства Bg14-3-3 (Scaffold 1582: 42425–42875) ) (Рис. 7A).

Рис 7. Модель B . glabrata 14-3-3 (BGLB005695) единственный экзонный ген содержит метилированные цитозины в своей кодирующей области.

A) ПЦР-амплификация ДНК, преобразованной бисульфитом, выявляет четыре сайта 5mC в Bg14-3-3. Бисульфитное преобразование гДНК с последующей ПЦР (BS-PCR) и секвенирование использовали для исследования статуса метилирования цитозинов в экзоне Bg14-3-3 (Scaffold1582: 42425–42875). После бисульфитной конверсии гДНК последовательности-мишени амплифицировали, субклонировали и затем секвенировали отдельные клоны.Закрашенный кружок указывает на присутствие 5 мкС; пустой кружок указывает на отсутствие 5mC. Каждый кружок представляет цитозин в контексте CpG. Цифры над кружками соответствуют положениям пары оснований. Указаны проценты 5mC, обнаруженные в каждом цитозине. Серый прямоугольник представляет CDS Bg14-3- 3, а пунктирные линии указывают амплифицированную область. B) Подтверждение метилированных CpG в пределах Bg14-3-3 с помощью WGBS. Скриншот браузера генома IGV v2.3 [57] гена Bg14-3-3 .Черные столбцы указывают на положение метилированного CpG, как определено WGBS (Genome Publication, находится на рассмотрении), а ось Y представляет степень метилирования (между 0–1) по оценке BSMAP v1.0.0 [100].

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g007

Гены 14-3-3 кодируют высококонсервативные белки, повсеместно экспрессируемые в эукариотах, и благодаря их взаимодействию с сигнальными молекулами участвуют в различных биологических путях [ 101]. Путем анализа 14 субклонированных ампликонов BS-PCR Bg14-3-3 и оценки статуса метилирования 13 сайтов CpG, содержащихся в этом единственном экзонном гене, мы смогли подтвердить предсказание CpGo / e и обнаружение метилирования ДНК WGBS. в экзонной области (451 пн) этого домашнего хозяйства B . glabrata ген. В частности, ~ 30% всех сайтов CpG в этой области Bg14-3-3 содержат метку метилирования, а четыре позиции CpG метилированы почти во всех клонах (фиг. 7A). Статус метилирования ДНК этих четырех сайтов CpG (CpG10-CpG13) также был сохранен в наборе данных WGBS (публикация генома, находится на рассмотрении) (рис. 7B), подтверждая стабильность этих эпигенетических меток в этом конкретном локусе. Внутригенное (ген-тело) метилирование положительно связано с транскрипцией [74,89,102].Следовательно, соответствует другим видам беспозвоночных [99,103,104] и подтверждается анализом WGBS и in silico для B . glabrata [26], метилирование ДНК улитки, по-видимому, преимущественно направлено на транскрипционные единицы хозяйственной функции (например, 14-3-3 в текущем исследовании). Известно, что гомолог 14-3-3 млекопитающих регулируется эпигенетическими модификациями, а паттерны аберрантного метилирования ДНК связаны с опухолевым генезом [105]. Соответственно, мы смогли продемонстрировать 5mC в экзонной области Bg14-3-3 и, следовательно, предположить аналогичную регуляторную роль метилирования ДНК для B . glabrata также гомолог.

Кроме того, в отличие от некоторых организмов, таких как D . melanogaster [76], Dictyostelium discoideum [65] и Entamoeba histolytica [106], где часто наблюдается метилирование не-CpG (т.е. CpH (H = T, A или C)), но общее с другими моллюски (например, C . gigas ; [107] и Chlamys farreri [25]), метилирование ДНК в B . glabrata , по-видимому, обычно ограничивается контекстом CpG (все цитозины в контексте, отличном от CpG, были преобразованы после обработки бисульфитом).Эти результаты согласуются с недавними наблюдениями Ittipraset et al . [83] и недавно сообщенный B . glabrata genome paper (Genome Publication, на рассмотрении). Поскольку обычно считается, что геномы, содержащие гомолог Dnmt1, в основном проявляют метилирование в пределах динуклеотидов CpG [71,89], наши результаты ( B . glabrata содержит гомолог DNMT1, рис. 3 и содержит метилирование CpG, рис. 7A и 7B). соответствуют этой точке зрения.

Продукты шистосомы модулируют транскрипцию

Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3

Чтобы успешно паразитировать на промежуточном хозяине моллюска, шистосомы должны преодолеть иммунный ответ улитки.Хотя точные механизмы, с помощью которых шистосомные паразиты совершают этот подвиг, до конца не изучены, линия клеток Bge обеспечивает мощную модель культуры in vitro для исследования сложного взаимодействия паразита и хозяина [108,109]. Считается, что инкубация Bge с продуктами трансформации личинок (LTP), происходящими из мирацидий в трансформацию спороцисты, имитирует события, которые обычно происходят внутри моллюсков-хозяев [110]. Несколько исследований ранее продемонстрировали, что модуляция различных генов улитки, опосредованная паразитами, происходит [77,111,112] с Knight et al .[113] также демонстрируют, что репозиция гена в ядре улитки происходит после воздействия паразитов. Эти события ядерной реорганизации, которые не являются случайными, как известно, влияют на экспрессию генов и могут быть вызваны присутствием метилированных CpGs [114,115]. Здесь, чтобы изучить, влияют ли продукты шистосом на регуляцию транскрипции компонентов механизма метилирования ДНК улитки, клетки Bge культивировали в присутствии или в отсутствие шистосомных LTP [58] и оценивали на предмет содержания Bgdnmt1 и Bgmbd2 / 3 (рис. 8). .

Рис 8. S . mansoni паразитарные продукты значительно увеличивают количество транскриптов ядра B . glabrata Компоненты оборудования для метилирования ДНК.

Анализ экспрессии qRT-PCR: A) Bgmbd2 / 3 и B) Bgdnmt1 в необработанном B . glabrata эмбриональных (Bge) клеток (контроль) по сравнению с клетками, обработанными продуктами трансформации личинок (LTP) [58]. Данные получены из дубликатов биологических образцов, и реакции qRT-PCR были выполнены в технических дубликатах.Значения Ct генов-мишеней были нормализованы до Bgactin [116]. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD) нормализованных средних значений, и t-критерий Стьюдента был выполнен для выявления различий экспрессии между LTP-обработанными и необработанными (контрольными) клетками Bge (*; p <0 . 05 ).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005246.g008

Интересно, что клетки Bge, подвергшиеся воздействию шистосомного LTP, значительно увеличивали экспрессию как Bgdnmt1 (рис. 8A), так и Bgmbd2 / 3 (рис. 8B), указывая на то, что эпигенетический механизм улитки реагирует на биотический стресс и специфически реагирует на продукты паразитов.В то время как перевод наших данных из клеточной системы в целые организмы должен быть осторожным, недавнее исследование продемонстрировало, что тканеспецифическое метилирование ДНК улитки Bg-hsp-70 временно зависит от воздействия естественных шистосом и инфекции [83]. В совокупности эти данные подтверждают пластичность модулированного шистосомами B . glabrata Аппарат метилирования ДНК в системах как клетки (Bge), так и всего организма (улитки). Для дальнейшего изучения функциональной значимости процессов, опосредованных метилированием ДНК во время реакции улитки на заражение паразитом, и определения того, какие конкретные пути модулируются эпигенетически, анализ метилирования / транскриптома ДНК инфицированных и инфицированных вирусов по всему геномуследует учитывать неинфицированных особей (или полученных от них клеток).

No related posts.